Criteri per la pratica trasfusionale

Senza entrare nel merito delle diverse patologie in grado di generare un’anemia più o meno grave ci limiteremo ad asserire che una trasfusione non è sempre e solo limitata ad una condizione di anemia ma anche altri stati patologici possono richiedere la trasfusione di sangue intero o di plasma che risultata utile anche per;

  • trattamento di quadri di ipoproteinemia
  • trattamento preventivo e terapeutico delle coagulopatie ed emorragie nei pazienti affetti da trombocitopenia, coagulopatia acquisita o congenita

inoltre non risulta curativa ma solo di supporto fin che non si sia risolta la causa determinante lo stato anemico.

Come detto in testa a questo sunto non si vuole entrare nel merito delle cause, ma una prima distinzione va fatta nella classificare l’anemia tra quelle come acuta iperacuta o cronica, perché nei primi due casi bisogna intervenire precocemente. Un’anemia acuta (es emorragia), può essere, almeno ad un primo approccio, difficile da differenziare, in quanto l’anemia sarà solo riferita ad un calo della volemia e non dell’ematocrito. Anche le proteine si manterranno inalterate almeno per le prime 12/24 ore. Dopo tale lasso di tempo la redistribizione dei fluidi corporei, soprattutto dal LEC, svelerà una diminuzione di ematocrito e proteine. E’ importante saper valutare queste differenze in quanto un’anemia acuta va trattata immediatamente con una trasfusione. 
Sintomi associati a tale stato sono ;

  • tachicardia
  • polso debole
  • pallore
  • estremità fredde
  • diminuzione della silouette cardiaca agli RX

Parametri da considerare per decidere quando eseguire una trasfusione sono:

  • il valore di ematocrito (<10-15% oppure <20% in caso di emorragia acuta
  • l’entità dei sintomi clinici legati all’anemia come letargia, debolezza, tachicardia, polso debole, dispnea, aumento del tempo di riempimento capillare, temperatura ecc. ecc.

Prima di procedere alla trasfusione di sangue vanno sempre eseguiti i test di emocompatibilità che nel gatto sono la determinazione del gruppo sanguigno e i test di compatibilità crociata (cross-matching) (vedi anche prove di compatibilità crociata in questo sito) La mancata o erronea determinazione del gruppo sanguigno può portare ad un emolisi anche in tempi rapidi ed aggravare lo stato anemico.

Il riscaldamento, va effettuato in bagnomaria, in termostato o per riscaldamento del deflussore la temperatura non deve superare i 37 gradi per non deteriorare il sangue. Esso va effettuato solo nei soggetti ipotermici, oppure nelle trasfusioni di elevati volumi di sangue in tempi brevi (trasfusioni massive con volumi di sangue >60 ml/kg nelle 24 ore o >30 ml/kg in 3 ore).

Per calcolare l’aumento dell’ematocrito (Hct) in seguito alla somministrazione dell’unità ematica si può dividere il volume ematico della trasfusione per il peso corporeo moltiplicato 2. Es un cane di 10 kg riceve 100 ml di sangue avrà un aumento dell’Hct sarà pari al 5%.

L’infusione deve avvenire per accesso venoso (vena cefalica, giugulare o femorale) con aghi di grande calibro, i deflussori devono essere muniti di filtri. La somministrazione dovrebbe essere, almeno nei primi 5 min molto lenta, una dose prova di pochi ml sarà utile a capire la risposta del soggetto e se non compaiono segni di incompatibilità, si può aumentare la velocità di somministrazione: 5-10 ml/kg/h nei pazienti normovolemici (o anche superiore nei pazienti ipovolemici con anemia da emorragia), nei soggetti cardiopatici o a rischio di ipervolemia (per patologie renali o polmonari) rimane al di sotto dei 5 ml/kg/ora. Si può trasfondere fino 22 ml/kg in non più di 4 ore. Solo la soluzione di sodio cloruro allo 0,9% può essere usata le altre possono dare origine a fenomeni di coagulazione ed emolisi. Le emazie trasfuse hanno un’emivita di 35 gg,se queste non vengono distrutte o perse per le stesse cause che hanno portato l’anemia. Le trasfusioni da altre specie sono controverse, secondo alcuni autori sono possibili ma l’emivita delle emazie è di pochi giorni, quindi potrebbero essere utili negli stati anemici acuti emorragici, altri studi dimostrano che i gatti di A possono emolizzare il sangue canino DEA 1.

La malattia emolitica neonatale o isoeritrolisi

La malattia emolitica neonatale o isoeritrolisi neonatale insorge nei gattini di gruppo sanguigno A o AB che nascono da madri di gruppo B, quando nelle prime 24 di vita assorbono a livello intestinale con il colostro gli alloanticorpi della madre di diverso gruppo sanguigno diretti contro i loro antigeni eritrocitari, con conseguente emolisi e insorgenza di anemia emolitica. La gravità dei sintomi clinici nel gattino dipende dalla quantità e qualità di colostro assunto. In genere questi gattini nascono sani ed energici e i sintomi compaiono da ore a giorni dopo l’ingestione del colostro. Alcuni muoiono in poche ore dall’assunzione del colostro senza mostrare sintomi, altri smettono di allattarsi a pochi giorni di vita e mostrano segni e sintomi di emolisi intravascolare (letargia, mucose pallide, itteriche, tachicardia e tachipnea, urine scure, collasso) e morte entro la prima settimana di vita. I gatti che sopravvivono sviluppano necrosi delle estremità di solito verso la terza settimana di vita, in particolare a livello di coda, dita (Figura 1), o padiglioni auricolari, dovuta all’azione di agglutinine fredde (IgM) che determinano insorgenza di agglutinazione, microcoaguli e ischemia con necrosi delle zone maggiormente fredde del corpo. La malattia emolitica neonatale è considerata la principale causa della “Fading Kitten Syndrome” ovvero della mortalità neonatale nel gatto. La prevenzione può avvenire evitando di accoppiare madri di gruppo sanguigno B con padri A o AB, oppure testando il gruppo sanguigno dei neonati (utilizzando poche gocce di sangue raccolte dal cordone ombelicale) ed evitando che i gattini di gruppo A o AB nati da una madre di gruppo sanguigno B assumano il colostro nelle prime 24 ore di vita23-27 .

Prove di compatibilità crociata per la medicina trasfusionale nel gatto

Concetto del test è quello di valutare in vitro (su vetrino e in provetta) eventuali reazioni provocate dal contatto tra il plasma del ricevente e i globuli rossi del donatore “prova major” ovvero emolisi e agglutinazione maggiore. Questo si tradurrà in vivo nella capacità del plasma del ricevente di emolizzare le emazie del donatore e quindi la trasfusione. La prova minor (emolisi e agglutinazione minore), sarà caratterizzata dalla capacità del plasma del donatore di emolizzare le emazie del ricevente.

Prima di descrivere la procedura va fatto un cenno a riguardo di strumentazioni e prelievi necessari per eseguire la prova

  • centrifuga
  • incubatore a 37 gradi (può essere sufficiente qualsiasi apparecchiatura presente in struttura anche dedicata ad altri processi es. coagulazione)
  • microscopio
  • 1 prelivo in provetta EDTA per il soggetto richiedente e uno per il donatore
  • 1 prelivo in provetta da siero di almeno 2ml, per il soggetto richiedente e uno per il donatore
  • pipette dosatrici

Perchè effettuare questo test?

Nel gatto oltre i tradizionali antigeni A B e AB è stato identificato un nuovo antigene denominato Mik, la cui diffusione nella popolazione felina non può essere valutata per mancanza di test specifici. L’assenza di questo antigene eritrocitario nel gatto ricevente può essere associato alla presenza nel medesimo soggetto di anticorpi anti-Mik. Questo è vero sopratutto nei gatti gruppo A. Questi anticorpi sono responsabili di reazioni trasfusionali emolitiche acute anche in caso di trasfusioni compatibili del sistema di gruppo AB. Quindi anche in soggetti dello stesso gruppo, se vi è presenza di questi anticorpi si potranno manifestare reazioni di emolisi ed agglutinazione Major e minor.

E’ sempre raccomandato?

Effettivamente nelle trasfusioni effettuate tramite sacca, piuttosto che tramite donatore, se presenti emazie come concentrati privi di plasma, cioè sospese in una soluzione salina e al mannitolo utili al mantenimento della pressione osmotica, viene a decadere il concetto di cross match, sarà possibile effettuare la sola prova major, ovvero la capacità del ricevente di emolizzare la donazione.

Esecuzione del test; cross matching major e minor Si effettuerà un prelievo in provetta con anticoagulante Tris EDTA dal donatore e dal ricevente e un prelievo in una provetta da siero dal donatore e dal ricevente (min 2 ml per prelievo), può essere sufficiente anche il solo Tris EDTA.

• centrifugare a 1000 rpm x 5-10 min. 2 ml di sangue intero (senza anticoagulante) del donatore e del ricevente (per ottenere siero), metterlo da parte, in una provetta previa identificazione. Centrifugare, a 1000 rpm x 5-10 min. la provetta con EDTA del donatore e ricevente per ottenere un sedimento costituito da eritrociti.

NB se abbiamo deciso di operare con il solo prelievo di EDTA sarà il plasma surnatante della provetta EDTA ad essere conservato per la cross reazione e sarà consigliabile un prelievo da 2,5 ml, se invece abbiamo optato per la doppia provetta questo potrà essere gettato.

• Creare una sospensione al 4% di emazie con 4,8 ml di soluzione salina (NaCl 0,9%) e 0,2 ml di eritrociti precedentemente centrifugati.

• Centrifugare, eliminare il surnatante e aggiungere nuovamente soluzione salina (4,8 ml). Ripetere il lavaggio per tre volte.

• Per evitare la formazione di rouleaux al termine dei lavaggi risospendere i globuli rossi lavati fino ad ottenere una sospensione di eritrociti al 4%, come su.

Compatibilità MAJOR, MINOR e allestimento del controllo in provetta

  • MAJOR: Miscelare 2 gocce di siero/plasma del ricevente ( 1 goccia corrisponde a circa 50 microlitri per chi possiede delle pipettatrici ) con 1 goccia di eritrociti del donatore in una provetta.
  • MINOR: 1 goccia di eritrociti ricevente + 2 gocce di siero/plasma del donatore in provetta.
  • Allestire contemporaneamente dei controlli
  • Controllo ricevente: 1 goccia di eritrociti del ricevente + 2 gocce del siero del ricevente.
  • Controllo donatore: 1 goccia di eritrociti del donatore + 2 gocce di siero del donatore.
  • NB il controllo deve essere necessariamente negativo; una reazione tra emazie e siero/plasma dello stesso soggetto deve essere per forza considerato invalidante il test. Un autoagglutinazione nel ricevente potrebbe essere suggestiva di anemia emolitica immunomediata.

Incubazione il cross match major e minor può essere posto in una eppendorf o altra provetta ad incubare a 37° C per 10-15 min.

Interpretazione dei risultati Osservare il colore del siero ad occhio per evidenziare la presenza di emolisi. Disporre, su vetrino portaoggetti, una o due gocce di sospensione siero/plasma con eritrociti dalle provette precedentemente incubate. Se c’è agglutinazione già ad occhio nudo sarà possibile distinguere la formazione di flocculi di emazie, è consigliabile anche l’osservazione al microscopio per l’identificazione di un’eventuale agglutinazione. Per meglio interpretare e comprendere il risultato delle prove allego una pubblicazione dell’AIVPA dove troverete in fig. 5 due prove positive e due negative. Anche se la pubblicazione è dedicata alla medicina trasfusionale del cane non cambiano i criteri interpretativi, in quanto la prova è ripetibile anche per i cani e gli effetti di una eventuale incompatibilità sono del tutto sovrapponibili. Inoltre noterete che l’agglutinazione nel primo vetrino di sinistra è meno marcata e potrebbe essere confusa con dei semplici rouleax, per questo motivo torno a sottolineare l’opportunità di un’osservazione microscopica.

Se compatibile: gli eritrociti formano una sospensione omogenea del tutto simile al sangue normale.

Se incompatibile: Si evidenzierà emolisi o agglutinazione degli eritrociti.

NOTE CONCLUSIVE: La positività della prova major indicherà la capacità del plasma del ricevente di emolizzare le emazie del donatore, la positività della prova minor indicherà la capacità del plasma del donatore di emolizzare le emazie del ricevente. La positività della prova major non implica la contemporanea positività della prova minor e viceversa.

Non confondere i rouleax con l’agglutinazione! nei primi le emazie sono impilate in colonna nelle seconde si trovano ammassate in formazioni globulari, tondeggianti.

EXTRA nel gatto anche la prima trasfusione può portare reazioni emolitiche importanti e letali

Procedura di campionamento dei versamenti

CAMPIONAMENTO DI VERSAMENTI ADDOMINALI E TORACICI

Lo scopo ultimo del campionamento e della lavorazione di un campione citologico è quello di:

  1. Classificare il tipo di versamento come trasudato, trasudato modificato o essudato. Questa classificazione richiede una quantificazione delle proteine tramite refrattometro e della sua cellularità, quest’ultima può essere ottenuta con un contaglobuli. Per questo è necessario campionare una parte del versamento in Tris EDTA (provetta per emocromo).
  2. Ottenere una fase liquida che caratterizzi biochimicamente il versamento (bisogna eseguire test biochimici paralleli tra siero e versamento).
  3. Allestire vetrini per l’indagine citologica e la classificazione come infiammatorio acuto, sub acuto o cronico, chiloso/pseudochiloso, neoplastico ecc. ecc.

Topografia Il prelievo di versamenti toracici, si esegue nel terzo inferiore del torace, in prossimità della giunzione costocondrale tra il sesto e settimo spazio intercostale. In quelli addominali si consiglia il prelievo 2 cm caudalmente all’ombelico, sulla linea mediana facendo attenzione a non raccogliere urina in vescica.

Aghi Si possono usare aghi tipo butterfly per cani di piccola taglia e gatti, oppure aghi e aghi cannula da 2 cm/19-21 G, aghi di 4 cm/18-20 G per cani di grossa taglia.

Provette 2 provette EDTA, in una metteremo il sangue del paziente in un’altra il liquido di versamento. 2 provette da siero, una delle quali necessariamente senza gel, in questa metteremo il liquido da versamento (almeno 6 ml), nell’altra sangue intero.

Dalle provette EDTA effettueremo un emocromo su sangue e sempre tramite macchina contaglobuli anche su versamento, che ci indicherà la cellularità riferita ai WBC e agli RBC .

  • La conta totale dei bianchi con le proteine e il peso specifico definirà quindi il tipo di versamento (trasudato, trasudato modificato, essudato)
  • Il tipo di bianchi invece ci potrà dire se si tratti di un versamento infiammatorio sub acuto o cronico.
  • L’ematocrito del versamento incrociato con l’ematocrito del sangue potrà ulteriormente classificarlo in emorragico.

Dalle provette da siero tramite centrifugazione a bassa velocità (max 1500 giri per 5 min.) andremo a separare la componente cellulare (sedimento) da quella liquida (surnatante). Il surnatante sarà prelevato con una pipetta Pasteur o simile e dispensato in una provetta per test biochimici.

  • Dal surnatante del versamento sarà fondamentale determinare in parallelo con il siero: le proteine totali con un refrattometro o direttamente nel biochimico, queste ci aiuteranno a classificare il versamento; la creatinina per la diagnosi di uroperitoneo, che sarà maggiore nel versamento rispetto al siero; il glucosio del versamento, che dovrebbe essere equiparabile tra i due dipartimenti. In caso il valore del versamento sia particolarmente basso bisogna tenere in considerazione la possibilità di un versamento a carattere settico. Per quanto concerne i versamenti chilosi e pseudochilosi si può’ far riferimento al rapporto trigliceridi/colesterolo che è maggiore di 1 nei chilosi e minore di 1 negli pseudochilosi, oppure al confronto tra versamento e siero. Il colesterolo nel versamento pseudochiloso è maggiore rispetto al sierico, nei chilosi i trigliceridi da versamento superano i sierici. Si potrà misurare la Bilirubina da versamento in parallelo con quella sierica. Nei versamenti biliari la concentrazione sierica sarà minore di quella da versamento.
  • Il sedimento servirà per la citologia: sarà prelevato con una pipetta e strisciato su vetrini, questi saranno colorati con Diff quick, per l’indagine citologica.
    Sarà utile preparare almeno 4-5 vetrini ed allestirli con la stessa procedura degli strisci ematici.

Il versamento potrà essere campionato per un’indagine microbiologica. Si può raccogliere il versamento direttamente in una siringa (sulla quale poi andremo a reinnestare l’ago e bloccare lo stantuffo per evitare la fuoriuscita del campione) questa potrà essere spedita in laboratorio, oppure si potrà inzuppare un tampone con terreno di trasporto. Questi metodi di raccolta sono utili sia per gli esami in aerobiosi che anaerobiosi

La coltura per aerobi è praticamente di routine, quella per gli anaerobi è consigliata soprattutto per i campioni da versamento toracico di gatto. NB. se si vuole inviare il versamento in una siringa è utile fissare lo stantuffo con del nastro in modo tale da impedire la fuoriuscita del contenuto nel trasporto. Se il campione tende a coagulare o formare fiocchi di fibrina il campionamento in KEDTA può evitare questi fenomeni. Di fondamentale importanza è indicare sui vetrini e provette e fogli di lavoro; nome del proprietario, dell’animale, la specie, la sede di campionamento ed il sospetto diagnostico. Ribadisco l’importanza di destinare un’aliquota del versamento in una provetta EDTA, per l’analisi con il contaglobuli. Analizzare un versamento non campionato in EDTA potrebbe ostruire o danneggiare l’apparecchiatura per formazioni di fiocchi di fibrina.

Schema sintetico per la diagnosi del cusching

Cushing

Presentazione pazienti anziani 8-12 anni razze predisposte beagle, femmine sterilizzate tendenzialmente in sovrappeso.

Surreno dipendente razze di grossa taglia e il 70% sono femmine.

Sintomatologia

 PU/DU polifagia

Aumento appetito

Alopecia simmetrica pelle sottile comedoni fragilità cutanea.

aumento di peso

pancia gonfia (addome a botte)

anestro atrofia genitali.

Alterazioni infrequenti e più gravi

Calcinosi cutanea, petecchie ecchimosi

Tromboembolismo polmonare

Segni neurologicici per via della massa ipofisaria.

Rilievi di laboratorio

Chimica clinica

ALP- aumento da 5 a 40 volte aumentato nel 90% di iperadrecorticismo

ALT-aumento di circa 5 volte

Albumine- aumentate o diminuite? Valutare lo stato di idratazione

AT III- aumentata

Acidi biliari- pre e post possono risultare aumentati

Glucosio- i valori potranno essere da normali ad aumentati

Urea e creatinina- la crea sarà nel terzo inferiore dell’intervallo di riferimento tendenzialmente bassa

L’urea a causa da una parte del catabolismo e dall’altra dalla poliuria darà valori imprevedibili.

Colesterolo e trigliceridi- col è aumentato D/D ipotiroidismo diabete nefropatie proteino disperdenti malattia colestatica pancreatite cronica.

 trigliceridi possono essere aumentati.

Alcalosi all’emogas

P se molto alto la prognosi può essere infausta

Esame delle urine

PS <1015 (o ipostenuriche) non valido con privazione all’acqua.

Proteinuria- si può avere PU/CU >0,5 anche fino a 10

Valutazioni preliminari

Non effettuare su cani con stati infiammatori valutare la proteina C reattiva se alta non procedere con la valutazione.

 Valutare il pattern cortisolemico tramite proteine di fase acuta PCR (precoce) diminuita per inibizione dell’infiammazione da parte degli steroidi, Aptoglobina (tardiva) aumentata come il ferro albumina e antitrombina alte

Pseudocushing

Stati algici (es discospondiliti)  

WHWT sono soggetti a fibrosi polmonare interstiziale che da un lato produce cortisolo dall’altro genera stress che fa aumentare la produzione di cortisolo

Cani con problematiche respiratorie es i brachicefali sono compresi

Collasso tracheale

Cecità SARDS

Diabete mellito

Idrocefalo

Atrofia corticale senile

Idrosingomielia (Cavalier king)

Dosaggio ormonale

Test di stimolazione con ACTH (ottimale per lo screening) e follow up

Pre ACTH i valori di cortisolo sono compresi tra i 20 e i 250 nmol/l il post tra 200 e 450 nmol/l

Il post superiore a 600 nmol/l a prescindere dai valori iniziali, con segni clinici compatibili e senza patologie concomitanti è altamente suggestivo di positività.

Condizioni stressanti (vedi su) e patologie come chetoacidosi diabetica o gastroenterite emorragica possono portare un marcato aumento di cortisolo e falsi positivi.

Anche valori compresi tra 450 nmol/l e 600 sono suggestivi soprattutto in presenza di sintomi.

Valori inferiori a 40 nel post, in presenza di segni clinici sono suggestivi di iperadrenocor. Iatrogeno.

PRO

Semplice rapido/Ottimale per il monitoraggio della terapia/distingue l’iper. spontaneo dallo iatrogeno

CONTRO

Non distingue tra primario e secondario

/falsi negativi soprattutto nel surrene dipendente

/falsi positivi in caso di stress cronico e malattia non surrenalica

Test di soppressione a bassi dosi ideale per la diagnosi

Si eseguono tre misurazioni To T1 (3-4 ore) T2 (8ore)

Andamento in cani normali (valori interni T0 da 1,5 a 5,0 micr.g/dl T1 e T2 <1,5micr,g/dl

T1 la soppressione deve essere 50% o > del valore iniziale

T2 la concentrazione scende sotto i 40 nmol/l  (<1,5micrg/dl)

Positività tipica (iperadr. Ipofisi dipendente)

T1 soppressione normale circa 40 nmol/l (<1,5micr.g/dl)

T2  fuga dall’effetto soppressivo valori superiori a 40 nmol/l (>1,5micr.g/dl)

Impossibilità nel distinguere ipofisario da surrenalico

Possibile origine surrenalica

Mancata soppressione della concentrazione in T1 e T2

Si possono avere riduzioni in T1 e T2 ma senza raggiungere la soppressione attesa

Pattern inverso

Mancanza di soppressione attesa in T1 soppressione in T2 (non chiaro il motivo) ma il test è da considerarsi positivo.

PRO

Maggiore sensibilità della stimolazione con Acth e sensibilità nel confermare il secondario.

CONTRO

 Non utile nel monitoraggio

/può dare falsi positivi in animali stressati e con patologie croniche

Cortisolo urinario/creatinina urianaria

Può essere necessaria un’omologazione dell’unità di misura

L’utilità di questo test risiede nell’elevato valore predittivo negativo è consigliato quando la possibilità di cushing è minima. Altamente sensibile non specifico.

NB il siero itterico interferisce con la lettura in chemioluminescenza. Itterico + emolitico in ELISA.

Il siero cortisolemico si conserva per una settimana a 4 gradi centigradi.

Il desametazone non viene rilevato dalla metodica il prednisoloneinterferisce per il 30% fino a 24 ore dopo la somministrazione. Il desametazone viene metabolizzato velocemente, in un cane sano l’effetto dura fino a 12 ore in un cusching meno