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Colorazione di Papanicolaou

Posted on 22 Luglio 202127 Marzo 2024 by Dott. Daniele Giacchetti

La colorazione di Papanicolaou, usata in citologia è utile soprattutto per lo studio delle cellule epiteliali, infatti è per gli strisci cervico-vaginali che George Papanicolaou introdusse questa colorazione (Pap test). La colorazione di Papanicolau è una colorazione di tipo tricromica

Applicazioni

Campioni ginecologici
Espettorato
Urina
Agoaspirati, (FNAB, fine needleaspiration biopsy agobiopsia con ago sottile) da organi diversi
Essudati
Lavaggi.

Risultati

Citoplasma:
- Cianofilo (basofilo) Blu; verde intenso
- Eosinofilo (acidofilo) Rosa
- Cheratinizzato Rosa arancio
Eritrociti: Rosso
Nuclei: Blu nero; violetto scuro

Principio della colorazione di Papanicolaou

Come detto la colorazione di Papanicolaou è di tipo multicromica ed è basata sull’utilizzo di più coloranti

Ematossilina
Orange G
Eosina
Verde Luce

in 3 soluzioni.

colorazione nucleare (ematossilina)
OG-6 (Orange G)
EA (Eosina e Verde Luce)

L’Ematossilina è il colorante nucleare

OG6 conferisce al citoplasma una colorazione dall’arancio brillante al giallo

L’eosina invece conferisce al citoplasma delle cellule pavimentose mature e superficiali una colorazione rosa; questa colorazione mette in risalto il carattere eosinofilo delle cellule cheratinizzate.

Il Verde Luce colora il citoplasma delle cellule basali e parabasali (cianofile), povere di cheratina e conferisce una colorazione verde-celeste.

La colorazione di Papanicolaou fornisce ottimi dettagli e contrasti cromatici della struttura nucleare. In oltre questa colorazione garantisce una sufficiente trasparenza del citoplasma e delle peculiari tonalità cromatiche tipiche degli stadi cellulari siano essi fisiologici e patologici(compresi gli inclusi)

dettaglio cromatico della cheratina — Colorazione Papanicolau su cellule epiteliali

Tutto ciò permette uno studio importante delle condizioni neoplastiche e flogistiche, anche associate a batteri e virus (HPV) .

PRO

Questa colorazione permette di apprezzare la fase di maturazione delle cellule, di identificare alterazioni dovute ad infezioni batteriche o virali e di valutare la predisposizione allo sviluppo del cancro.

CONTRO

La colorazione di Papanicolaou può avere procedure lunghe e complesse, ed è per ovviare a questo che sono state sviluppate formulazioni fast che hanno tempi e modi di lavoro più semplici; questo comporta una maggiore fruibilità della colorazione e un ausilio in diagnostica. Resta di fondamentale importanza la preparazione del citologo

Richiedi un campione

colorazione rapida con alcool (tempo min 2:30″ max 4 min.)

Metodo

Immergere rapidamente 10-15 volte in soluzione fisiologica per un secondo i vetrini, precedentemente fissati all’aria.
Passare rapidamente in immersione per 10-15 volte in alcool 96°
immergere il vetrino nella suluzione 1 per 30-60 sec.
sciacquare per 10 sec con acqua di fonte
immergere per 20-30″ in Blue water
sciacquare con 6 rapidi passaggi in acqua di fonte
8-10 immersioni rapide in alcool a 96°
immergere il vetrino nella suluzione 2 per 30-60 sec.
immergere rapidamente 10-15 volte in alcool 96°

colorazione rapida senza alcool

Metodo

Vetrini fissati all’aria passaggio uno
Colorare i nuclei con ematossilina per 2-5 minuti.
Risciacquare rapidamente con acqua distillata.
Acqua di Scott (blu water), 3-5 minuti.
Risciacquare con acqua distillata.
Golding soluzione di colorazione per 2-5 minuti.
Risciacquare rapidamente con acqua distillata.
Disidratare rapidamente con etanolo.

A questo link potete trovare informazioni per chi vuole approfondire

Colorazioni di May Grünwald-Wright-Giemsa

Posted on 20 Aprile 202126 Luglio 2021 by Dott. Daniele Giacchetti

Le colorazioni di May Grünwald-Wright-Giemsa sono tecniche di colorazione tipo Romanovsky, cioè metacromatiche differenziali. Queste possono essere usate separatamente o come May Grünwald -Giemsa e o Wright-Giemsa.

La base è sempre costituita dal blu di metilene e eosina e una soluzione alcolica, a queste si può aggiungere uno dei tre coloranti May Grünwald-Wright-Giemsa, oppure questi possono essere usati come coloranti unici. In questo caso prevedono i coloranti di base in un’unica soluzione alcolica . ES. la soluzione di Giemsa, è una miscela complessa, costituita da blu di metilene cloruro, blu di
metilene eosinato, azurro II eosinato. (soluzione alcolica completa)

USO

Le colorazioni di May Grünwald-Wright-Giemsa sono indicati soprattutto per lo studio parassitologico e citologico di campioni ematici e linfatici, fecali, (liquido duodenale e chilo) liquido cerebrospinale, delle sierose e del reticolo endoteliale

In generale una colorazione standard richiede circa 30 min, per questo si può presentare di difficile utilizzo nella pratica ambulatoriale, soprattutto per flussi di lavoro notevoli.

Caratteristiche prestazionali

I nuclei assumeranno svariate tonalità di viola. Il colore del citoplasma sarà di varie gradazioni, dal blu al rosa pallido. Nel citoplasma di alcuni tipi di cellule potrebbero comparire alcuni granuli dal rossiccio al lilla. I basofili saranno caratterizzati dalla presenza di granuli tra il blu scuro e il nero nel citoplasma. Gli eosinofili saranno caratterizzati dalla presenza di granuli di color arancione vivo nel citoplasma. I globuli rossi dovrebbero assumere un colore tra il rosa e l’arancione.

Questi coloranti in modo angolo al Diff Quick sono utili all’identificazione dei trofozoiti del Phylum Apicomplexa oltre parassiti fecali ed emoparassiti. Meno adeguati sono all’identificazione delle forme cistiche.

Dientamoeba fragilis
Pneumocystis
Plasmodium falciparum
Toxoplasma
Flagellati
Microsporidi
Epatozoon
Piroplasmi

Bisogna comunque precisare che per le oocisti di coccidi come Cyclospora, Isospora, Sarcocystis, Toxoplasma e per uno studio più approfondito del materiale fecale è preferibile utilizzare e/o affiancare altre colorazioni, che possono implementare lo studio di Apicomplexa anche nelle sue forme cisitiche.

Interpretazione

le cellule appariranno di colore azzurro o azzurro-grigi per il citoplasma e rosso-porpora viola per il nucleo.

La soluzione di May Grünwald, costituita da eosinato di blu di metilene che colora i nuclei in blu ed il citoplasma basofilo in rosso-rosa La soluzione di Giemsa, aumenta l’intensità della colorazione nucleare e la capacità di evidenziare selettivamente gli elementi cellulari e il reticolo endoplasmatico

Pro

Coloranti che permettono un buono studio citologico e dei parassiti associati a diversi campioni

Contro

Le colorazioni di May Grünwald-Wright-Giemsa sono piuttosto complesse da gestire sia a livello di sicurezza (tossicità), oltre che di metodo. I tempi id colorazione possono arrivare a oltre 35 minuti.

E’ preferibile usare il Diff Quick per sfruttare questo tipo di colorazione, più altre colorazioni non differenziali per integrare lo spettro analitico.

Richiedi un campione

Siamo in grado di fornire un kit di colorazione rapida tipo Giemsa, con la seguente procedura, richiedi un campione grtuito

Metodo Giemsa rapido

Dopo avere asciugato all’aria lo striscio di sangue, immergerlo nella soluzione di Giemsa non diluita per 5–6 minuti.
Immergere in acqua deionizzata per 2–4 minuti, in base alle proprie preferenze di colore.
Sciacquare in acqua deionizzata.
Asciugare all’aria ed esaminare al microscopio.

Oppure la colorazione standard

Metodo Giemsa standard

Fissare i vetrini in metanolo per 5–7 minuti.
Asciugare all’aria.
Diluire la colorazione di Giemsa con tampone a pH 7,2 rapporto 1:20. È possibile apportare modifiche alla tonalità del colore diluendo con il tampone.
Colorare la pellicola per 20–30 minuti.
Sciacquare in acqua deionizzata.
Asciugare all’aria ed esaminare al microscopio.

NB Nella valutazione dei risultati va ricordato che: il quadro cromatico è
fortemente influenzato dal pH delle acque di lavaggio e del tampone di diluizione; l’intensità della colorazione può variare in funzione dei tempi di differenziazione. TUTTE LE SOLUZIONI SONO FORNITE, subito pronti al lavoro.

Diff Quick Stain

Posted on 11 Aprile 202121 Aprile 2021 by Dott. Daniele Giacchetti

CARATTERISTICHE

Il Diff Quick Stain è una colorazione rapida tipo Romanowsky, ovvero metacromatica. La metacromasia si esprime con una gamma di variazioni cromatiche che rendono le colorazioni come il Diff Quick di tipo differenziale. Per la rapidità e la facilità di utilizzo il Diff Quick è la colorazione differenziale più usata.

I coloranti come May Grunwald/Giemesa/Wright rappresentano altri tipi di colorazioni Romanovsky.

.E’ costituito da due coloranti e un fissativo alcoolico.

Fissativo alcolico
Eosina acida ad affinità con elementi basici che appaiono dal rosa al viola (metacromasia).
Blu di metilene basico ad affinità con acidi nucleici che appunto appaiono blu

E’ importante sottolineare che questo tipo di colorante è maggiormente indicato per elementi citoplasmatici ed extracellualri come

mucine citolpasmatiche e extracellulari
goccioline di grasso
granuli neurosecretori
colloide
sostanza fondamentale

La variabilità chimica e le caratteristiche di pH legate alle qualità anfotere delle proteine, permette l’espressione delle caratteristiche metacromatiche.

il nucleo si colora in viola/porpora, ma con pochi contrasti, il citoplasma si colora in blu/celeste/grigio, tuttavia campioni diversi possono presentare colorazioni e tonalità differenti. Ad ogni modo come è stato detto, il blu e il rosso restano i colori fondamentali di questa colorazione.

PRO

il DIFF QUICK, come indica la parola stessa rappresenta un METODO RAPIDO E PRATICO di colorazione tipo Romanowsky. Si effettua in pochi e semplici passaggi, non sono richieste particolari precauzioni.

ottimo colorante per l’ematologia
su strisci ematici è inoltre possibile evidenziare #Nematodi, #Mycoplasmi e parassiti appartenenti al Phylum #Apicomplexa
E’ un ottimo colorante per la citologia (soprattutto per la valutazione del citoplasma) e una colorazione, anche per una valutazione preliminare della qualità del campione, non può prescindere da questo colorante.

CONTRO

Incompleto per la citologia. E’ preferibile affiancare altre colorazioni.
Praticamente del tutto inadeguato in microbiologia: In un campione citologico purulento, può aiutarci ad identificare neutrofili in fagocitosi verso batteri o neutrofili con caratteristiche di degenerazione, anche settica, ma in nessun modo potrà fornirci dati accurati sulla specie in questione se non una grossolana distinzione tra cocchi e bastoncelli

UTILIZZO

Semplice da usare, dopo aver strisciato il campione su vetrino e fatto essiccare questo si immerge nella prima soluzione alcolica

Immergere il vetrino 5 volte per 1-2 secondi nella soluzione fissativa alcolica. Attendere che l’alcol evapori
Immergere il vetrino 5 volte per 1-2 secondi nella soluzione rossa. Inclinare il vetrino e attendere un istante per eliminare l’eccesso.
Immergere il vetrino 5 volte per 1-2 secondi nella soluzione blu. Inclinare il vetrino e attendere un istante per eliminare l’eccesso.
Lavaggio con acqua
Si lascia asciugare il vetrino all’aria.

Fare attenzione ai contenitori dove si ripongono ed usano i coloranti che siano chiudibili ermeticamente, soprattutto il blu tende ad ossidarsi e a perdere le proprie caratteristiche di colorante

Diff Quick Stain — coloranti contenuti in contenitori ermetici, primo da sinistra alcol, seguono eosina, blu di metilene e facoltativamente un contenitore con acqua distillata per il risciacquo

per informazioni commerciali e tecniche contattaci

Coloranti e colorazioni in citologia

Posted on 11 Aprile 202126 Luglio 2021 by Dott. Daniele Giacchetti

La conoscenza dei coloranti e delle colorazioni diagnostiche e delle loro caratteristiche, può essere molto utile in laboratorio, per di più in una disciplina poco esatta come la citologia. In altre parole comprendere le loro caratteristiche e le modalità di utilizzo, sarà di aiuto nello studio e nella caratterizzazione dei campioni.

Al fine di perseguire questi obiettivi si tratterà particolarmente di alcune caratteristiche salienti

pregi e difetti per il campione studiato
facilità di utilizzo
economia dei prodotti

E’ importante sottolineare che lo stesso principio di colorazione può avere metodiche applicative e risultati diversi. In altre parole ogni produttore, in fase di produzione può conferire caratteristiche uniche allo stesso tipo di colorante.

Procedura di campionamento dei versamenti

Posted on 18 Marzo 20192 Maggio 2019 by Dott. Daniele Giacchetti

CAMPIONAMENTO DI VERSAMENTI ADDOMINALI E TORACICI

Lo scopo ultimo del campionamento e della lavorazione di un campione citologico è quello di:

Classificare il tipo di versamento come trasudato, trasudato modificato o essudato. Questa classificazione richiede una quantificazione delle proteine tramite refrattometro e della sua cellularità, quest’ultima può essere ottenuta con un contaglobuli. Per questo è necessario campionare una parte del versamento in Tris EDTA (provetta per emocromo).
Ottenere una fase liquida che caratterizzi biochimicamente il versamento (bisogna eseguire test biochimici paralleli tra siero e versamento).
Allestire vetrini per l’indagine citologica e la classificazione come infiammatorio acuto, sub acuto o cronico, chiloso/pseudochiloso, neoplastico ecc. ecc.

Topografia Il prelievo di versamenti toracici, si esegue nel terzo inferiore del torace, in prossimità della giunzione costocondrale tra il sesto e settimo spazio intercostale. In quelli addominali si consiglia il prelievo 2 cm caudalmente all’ombelico, sulla linea mediana facendo attenzione a non raccogliere urina in vescica.

Aghi Si possono usare aghi tipo butterfly per cani di piccola taglia e gatti, oppure aghi e aghi cannula da 2 cm/19-21 G, aghi di 4 cm/18-20 G per cani di grossa taglia.

Provette 2 provette EDTA, in una metteremo il sangue del paziente in un’altra il liquido di versamento. 2 provette da siero, una delle quali necessariamente senza gel, in questa metteremo il liquido da versamento (almeno 6 ml), nell’altra sangue intero.

Dalle provette EDTA effettueremo un emocromo su sangue e sempre tramite macchina contaglobuli anche su versamento, che ci indicherà la cellularità riferita ai WBC e agli RBC .

La conta totale dei bianchi con le proteine e il peso specifico definirà quindi il tipo di versamento (trasudato, trasudato modificato, essudato)
Il tipo di bianchi invece ci potrà dire se si tratti di un versamento infiammatorio sub acuto o cronico.
L’ematocrito del versamento incrociato con l’ematocrito del sangue potrà ulteriormente classificarlo in emorragico.

Dalle provette da siero tramite centrifugazione a bassa velocità (max 1500 giri per 5 min.) andremo a separare la componente cellulare (sedimento) da quella liquida (surnatante). Il surnatante sarà prelevato con una pipetta Pasteur o simile e dispensato in una provetta per test biochimici.

Dal surnatante del versamento sarà fondamentale determinare in parallelo con il siero: le proteine totali con un refrattometro o direttamente nel biochimico, queste ci aiuteranno a classificare il versamento; la creatinina per la diagnosi di uroperitoneo, che sarà maggiore nel versamento rispetto al siero; il glucosio del versamento, che dovrebbe essere equiparabile tra i due dipartimenti. In caso il valore del versamento sia particolarmente basso bisogna tenere in considerazione la possibilità di un versamento a carattere settico. Per quanto concerne i versamenti chilosi e pseudochilosi si può’ far riferimento al rapporto trigliceridi/colesterolo che è maggiore di 1 nei chilosi e minore di 1 negli pseudochilosi, oppure al confronto tra versamento e siero. Il colesterolo nel versamento pseudochiloso è maggiore rispetto al sierico, nei chilosi i trigliceridi da versamento superano i sierici. Si potrà misurare la Bilirubina da versamento in parallelo con quella sierica. Nei versamenti biliari la concentrazione sierica sarà minore di quella da versamento.
Il sedimento servirà per la citologia: sarà prelevato con una pipetta e strisciato su vetrini, questi saranno colorati con Diff quick, per l’indagine citologica.
Sarà utile preparare almeno 4-5 vetrini ed allestirli con la stessa procedura degli strisci ematici.

Il versamento potrà essere campionato per un’indagine microbiologica. Si può raccogliere il versamento direttamente in una siringa (sulla quale poi andremo a reinnestare l’ago e bloccare lo stantuffo per evitare la fuoriuscita del campione) questa potrà essere spedita in laboratorio, oppure si potrà inzuppare un tampone con terreno di trasporto. Questi metodi di raccolta sono utili sia per gli esami in aerobiosi che anaerobiosi

La coltura per aerobi è praticamente di routine, quella per gli anaerobi è consigliata soprattutto per i campioni da versamento toracico di gatto. NB. se si vuole inviare il versamento in una siringa è utile fissare lo stantuffo con del nastro in modo tale da impedire la fuoriuscita del contenuto nel trasporto. Se il campione tende a coagulare o formare fiocchi di fibrina il campionamento in KEDTA può evitare questi fenomeni. Di fondamentale importanza è indicare sui vetrini e provette e fogli di lavoro; nome del proprietario, dell’animale, la specie, la sede di campionamento ed il sospetto diagnostico. Ribadisco l’importanza di destinare un’aliquota del versamento in una provetta EDTA, per l’analisi con il contaglobuli. Analizzare un versamento non campionato in EDTA potrebbe ostruire o danneggiare l’apparecchiatura per formazioni di fiocchi di fibrina.