Categoria: Ematologia

I gruppi sanguigni del sistema AB nel gatto, per quanto facilmente individuabili, non riescono a garantire una pratica trasfusionale senza reazioni avverse.

Questo sunto è tratto da Veterinaria Anno 29, n° 5, Ottobre 2015, troverete più avanti il link che vi indirizzerà all’articolo completo.

Approccio ai gruppi sanguigni del gatto

Antigeni

• Nel gatto è riconosciuto un sistema di gruppi sanguigni basato sull’antigene A e B e antigene eritrocitario Mik
• dominante A il più frequente soprattutto nel gatto europeo
• recessivo B
  Il gruppo B ha una maggiore prevalenza nelle razze British Shorthair, Birmano, Devon e Cornish Rex, Abissino, Somalo, Turkish Van e Turkish Angora
• combinazione dei 2 gruppi AB
  Il gruppo AB è molto raro è presente in gatti domestici a pelo lungo e corto e nella razza Abbissina, Birmana, British shorthair, Norvegese, Persiano, Scottish fold, Cornish rex, Devon rex, Maine Coon, Manx, Ragdoll, Sphynx, Bengalese, Egiziano e Siberiano.
• di recente isolamento (2007) antigene eritrocitario Mik
  La diffusione purtroppo non può essere valutata per mancanza di test specifici ed è soprattutto quest’ultimo a generare reazioni trasfusionali avverse anche con compatibilità del gruppo AB.

Alloanticorpi e fiosiopatologia

Sopratutto i gatti di gruppo A possono essere provvisti di alloanticorpi (anticorpi naturali) anti Mik proprio perché privi di tale antigene. Gli anticorpi anti Mik e anti A o B nel gatto sono anticorpi preformati, naturali, detti Alloanticorpi, si formano nei primi mesi di vita e la loro formazione non richiede il contatto con gli antigeni verso i quali sono rivolti. Sono questi anticorpi che si rendono responsabili di reazioni trasfusionali avverse come l’agglutinazione e l’emolisi, anche in caso di compatibilità trasfusionale testata con i tradizionali gruppi sanguigni del sistema A e B. Per quanto detto, si intuisce facilmente che il semplice test del sistema AB non è in grado di escludere reazioni di rigetto neanche alla prima trasfusione, per questo motivo in questa specie oltre la determinazione del gruppo sanguigno andrebbe sempre eseguito il crossing match tra donatore e ricevente.

• 1/3 dei gatti di gruppo A, possiede immunoglobuline (alloanticorpi) a basso titolo (1:2), con debole azione emolizzante rivolta nei confronti dell’antigene eritrocitario di gruppo B.
• Tutti i soggetti di gruppo sanguigno B sono dotati di immunoglobuline (alloanticorpi) ad alto titolo (da >1:32 fino a 1:2048) con azione emolizzante (IgG e IgM) e agglutinante (IgM) nei confronti dell’antigene eritrocitario di gruppo A.
• Gli anticorpi anti emazie non sono invece presenti nei gatti di gruppo AB.

Possibili interazioni antigene anticorpo post-trasfusionale e caratteristiche cliniche

• I gatti A e B vanno trasfusi con i gruppi corrispondenti (ma reazioni avverse si possono comunque manifestare per la presenza dell’antigene Mik, soprattutto nel gruppo A)
• I gatti del gruppo AB, in caso di irreperibilità di sangue dello stesso gruppo, possono ricevere concentrati di globuli rossi di gruppo A o B, evitando di trasfondere la componente plasmatica che potrebbe contenere anticorpi nei confronti dell’antigene A o B presente sui globuli rossi del ricevente.
  Per quanto detto e non considerando l’antigene Mik, un
• Gruppo B trasfuso in un A può dar vita a manifestazioni cliniche importanti di carattere agglutinante ed emolizzante in sede intravascolare che si realizza nel giro di poco tempo, per la presenza di anticorpi naturali.
• Un gruppo A in un gruppo B in 1/3 dei casi darà origine a reazioni meno intense e a carattere emolizzante, con un’emivita delle emazie di 2 gg per rimozione extravascolare delle emazie con segni clinici poco evidenti.

Metodi per la caratterizzazione dei gruppi sanguigni

• I kit rapidi a uso ambulatoriale per la determinazione del gruppo sanguigno mostrano buona sensibilità e specificità nella determinazione dei gruppi sanguigni, tuttavia il gruppo AB che può essere segnalato come B.
  Per questo motivo, idealmente, sarebbe consigliabile confermare la positività del gruppo B con metodiche dotate di maggiore specificità, come
• l’agglutinazione in provetta, oppure eseguendo il test di back typing. In questi test il plasma dei gatti di gruppo sanguigno B o AB viene messo a contatto con eritrociti di gruppo A. Nel caso si tratti di plasma appartenente a un gatto di gruppo B si verifica una forte agglutinazione tra gli anticorpi plasmatici e gli antigeni eritrocitari, che è invece assente nel caso in cui il plasma appartenga a un gatto di gruppo AB.
  Questi test sono di difficile attuazione e andrebbero effettuati da laboratori qualificati.
• Test genetici a partire da tamponi di mucosa buccale ma non sono in grado di determinare il gruppo AB.

Legislazione e caratteristiche per la donazione

Il ministero della salute ha stilato delle linee guida per la medicina trasfusionale in questa parte saranno brevemente riassunte, si rimanda al link per un approfondimento

I donatori devono essere testati per le infezioni trasmissibili per via ematica come quelle sostenute dai retrovirus FIV e FeLV e dai micoplasmi emotropi che sono in grado di sopravvivere fino a una settimana negli eritrociti delle unità ematiche conservate.

Caratteristiche di idoneità per la donazione di sangue nella specie felina

• Peso corporeo 5-7 kg
• Età 2-8 anni
• Regolari vaccinazioni per calicivirosi, herpesvirosi, panleucopenia vaccinazioni infettiva, clamidiosi, leucemia virale (queste due per ultime vaccinazioni solo se il gatto è a rischio)
• Carattere Docile
• Quantità 1,5-2% del volume ematico corporeo da prelevare ogni 9 settimane non superando i 10 ml/kg
• Identificazione Microchip registrato nella banca dati della struttura preposta al prelievo di sangue

Esami da eseguire prima di ogni donazione nei gatti donatori di sangue riportati nella linea guida ministeriale

• Gruppo sanguigno A, B e AB
• Esame emocromo citometrico RBC, Hgb, Hct, MCV, MCH, MCHC, emocromocitometrico RDW, WBC con formula leucocitaria, PLT, MPV con annessa valutazione microscopica di uno striscio di sangue per la ricerca di parassiti ematici. Esami biochimici, Proteine totali, albumina, urea, ALP, ALT
• Profilo coagulativo PT, aPTT, fibrinogeno
• Esami sierologici FIV, FeLV, FIP
• In base alla zona geografica e all’epidemiologia anche Rickettsia spp, Anaplasma spp, Ehrlichia spp, Cytauxzoon felis e Leishmania spp.
• Esame delle urine, esame chimico-fisico e del sedimento Esame delle
• feci Esame parassitologico

puoi consultare anche; Linea guida per l’esercizio delle attività sanitarie riguardanti la medicina trasfusionale in campo veterinario

Materiali, metodi e procedure per la raccolta del sangue

La raccolta del sangue per il gatto può essere problematica per via delle quantità esigue di sangue rispetto all’anticoagulante presente nelle sacche concepite per l’umana che alla fine della trasfusione risulterebbero troppo diluite. In alternativa si può caricare dell’anticoagulante, raccolto da sacche in siringhe da 20 a 60 ml, o utilizzare appositi dispositivi chiusi per la raccolta del sangue. Un’altra problematica è legata all’indole del gatto, meno malleabile rispetto al cane che spesso può richiedere una contenzione farmacologica. Per questi ed altri aspetti di ordine pratico vi rimando a questa pubblicazione da cui ho tratto il materiale per la redazione di questo sunto. Veterinaria pg 43

EXTRA la prova di agglutinazione in provetta, è il gold standard per la determinazione dei gruppi sanguigni il test dotato della maggiore sensibilità e specificità. Utilizza come antisiero per l’identificazione degli eritrociti di gruppo A, il plasma di un gatto di gruppo B e come antisiero degli eritrociti di gruppo B, la lectina del Triticum vulgaris. Nonostante la maggiore sensibilità e specificità rispetto ad altri test disponibili, questa metodica ha alcuni svantaggi e limitazioni rappresentati dalla difficile reperibilità dei reagenti e dai lunghi tempi di esecuzione (circa 45 minuti). Per questi motivi è una tecnica il cui impiego è limitato ai laboratori di diagnostica specializzata o ai centri trasfusionali.

Senza entrare nel merito delle diverse patologie in grado di generare un’anemia più o meno grave ci limiteremo ad asserire che una trasfusione non è sempre e solo limitata ad una condizione di anemia ma anche altri stati patologici possono richiedere la trasfusione di sangue intero o di plasma che risultata utile anche per;

• trattamento di quadri di ipoproteinemia
• trattamento preventivo e terapeutico delle coagulopatie ed emorragie nei pazienti affetti da trombocitopenia, coagulopatia acquisita o congenita

inoltre non risulta curativa ma solo di supporto fin che non si sia risolta la causa determinante lo stato anemico.

Come detto in testa a questo sunto non si vuole entrare nel merito delle cause, ma una prima distinzione va fatta nella classificare l’anemia tra quelle come acuta iperacuta o cronica, perché nei primi due casi bisogna intervenire precocemente. Un’anemia acuta (es emorragia), può essere, almeno ad un primo approccio, difficile da differenziare, in quanto l’anemia sarà solo riferita ad un calo della volemia e non dell’ematocrito. Anche le proteine si manterranno inalterate almeno per le prime 12/24 ore. Dopo tale lasso di tempo la redistribizione dei fluidi corporei, soprattutto dal LEC, svelerà una diminuzione di ematocrito e proteine. E’ importante saper valutare queste differenze in quanto un’anemia acuta va trattata immediatamente con una trasfusione. 
Sintomi associati a tale stato sono ;

• tachicardia
• polso debole
• pallore
• estremità fredde
• diminuzione della silouette cardiaca agli RX

Parametri da considerare per decidere quando eseguire una trasfusione sono:

• il valore di ematocrito (<10-15% oppure <20% in caso di emorragia acuta
• l’entità dei sintomi clinici legati all’anemia come letargia, debolezza, tachicardia, polso debole, dispnea, aumento del tempo di riempimento capillare, temperatura ecc. ecc.

Prima di procedere alla trasfusione di sangue vanno sempre eseguiti i test di emocompatibilità che nel gatto sono la determinazione del gruppo sanguigno e i test di compatibilità crociata (cross-matching) (vedi anche prove di compatibilità crociata in questo sito) La mancata o erronea determinazione del gruppo sanguigno può portare ad un emolisi anche in tempi rapidi ed aggravare lo stato anemico.

Il riscaldamento, va effettuato in bagnomaria, in termostato o per riscaldamento del deflussore la temperatura non deve superare i 37 gradi per non deteriorare il sangue. Esso va effettuato solo nei soggetti ipotermici, oppure nelle trasfusioni di elevati volumi di sangue in tempi brevi (trasfusioni massive con volumi di sangue >60 ml/kg nelle 24 ore o >30 ml/kg in 3 ore).

Per calcolare l’aumento dell’ematocrito (Hct) in seguito alla somministrazione dell’unità ematica si può dividere il volume ematico della trasfusione per il peso corporeo moltiplicato 2. Es un cane di 10 kg riceve 100 ml di sangue avrà un aumento dell’Hct sarà pari al 5%.

L’infusione deve avvenire per accesso venoso (vena cefalica, giugulare o femorale) con aghi di grande calibro, i deflussori devono essere muniti di filtri. La somministrazione dovrebbe essere, almeno nei primi 5 min molto lenta, una dose prova di pochi ml sarà utile a capire la risposta del soggetto e se non compaiono segni di incompatibilità, si può aumentare la velocità di somministrazione: 5-10 ml/kg/h nei pazienti normovolemici (o anche superiore nei pazienti ipovolemici con anemia da emorragia), nei soggetti cardiopatici o a rischio di ipervolemia (per patologie renali o polmonari) rimane al di sotto dei 5 ml/kg/ora. Si può trasfondere fino 22 ml/kg in non più di 4 ore. Solo la soluzione di sodio cloruro allo 0,9% può essere usata le altre possono dare origine a fenomeni di coagulazione ed emolisi. Le emazie trasfuse hanno un’emivita di 35 gg,se queste non vengono distrutte o perse per le stesse cause che hanno portato l’anemia. Le trasfusioni da altre specie sono controverse, secondo alcuni autori sono possibili ma l’emivita delle emazie è di pochi giorni, quindi potrebbero essere utili negli stati anemici acuti emorragici, altri studi dimostrano che i gatti di A possono emolizzare il sangue canino DEA 1.

La malattia emolitica neonatale o isoeritrolisi neonatale insorge nei gattini di gruppo sanguigno A o AB che nascono da madri di gruppo B, quando nelle prime 24 di vita assorbono a livello intestinale con il colostro gli alloanticorpi della madre di diverso gruppo sanguigno diretti contro i loro antigeni eritrocitari, con conseguente emolisi e insorgenza di anemia emolitica. La gravità dei sintomi clinici nel gattino dipende dalla quantità e qualità di colostro assunto. In genere questi gattini nascono sani ed energici e i sintomi compaiono da ore a giorni dopo l’ingestione del colostro. Alcuni muoiono in poche ore dall’assunzione del colostro senza mostrare sintomi, altri smettono di allattarsi a pochi giorni di vita e mostrano segni e sintomi di emolisi intravascolare (letargia, mucose pallide, itteriche, tachicardia e tachipnea, urine scure, collasso) e morte entro la prima settimana di vita. I gatti che sopravvivono sviluppano necrosi delle estremità di solito verso la terza settimana di vita, in particolare a livello di coda, dita (Figura 1), o padiglioni auricolari, dovuta all’azione di agglutinine fredde (IgM) che determinano insorgenza di agglutinazione, microcoaguli e ischemia con necrosi delle zone maggiormente fredde del corpo. La malattia emolitica neonatale è considerata la principale causa della “Fading Kitten Syndrome” ovvero della mortalità neonatale nel gatto. La prevenzione può avvenire evitando di accoppiare madri di gruppo sanguigno B con padri A o AB, oppure testando il gruppo sanguigno dei neonati (utilizzando poche gocce di sangue raccolte dal cordone ombelicale) ed evitando che i gattini di gruppo A o AB nati da una madre di gruppo sanguigno B assumano il colostro nelle prime 24 ore di vita23-27 .

Concetto del test è quello di valutare in vitro (su vetrino e in provetta) eventuali reazioni provocate dal contatto tra il plasma del ricevente e i globuli rossi del donatore “prova major” ovvero emolisi e agglutinazione maggiore. Questo si tradurrà in vivo nella capacità del plasma del ricevente di emolizzare le emazie del donatore e quindi la trasfusione. La prova minor (emolisi e agglutinazione minore), sarà caratterizzata dalla capacità del plasma del donatore di emolizzare le emazie del ricevente.

Prima di descrivere la procedura va fatto un cenno a riguardo di strumentazioni e prelievi necessari per eseguire la prova

• centrifuga
• incubatore a 37 gradi (può essere sufficiente qualsiasi apparecchiatura presente in struttura anche dedicata ad altri processi es. coagulazione)
• microscopio
• 1 prelivo in provetta EDTA per il soggetto richiedente e uno per il donatore
• 1 prelivo in provetta da siero di almeno 2ml, per il soggetto richiedente e uno per il donatore
• pipette dosatrici

Perchè effettuare questo test?

Nel gatto oltre i tradizionali antigeni A B e AB è stato identificato un nuovo antigene denominato Mik, la cui diffusione nella popolazione felina non può essere valutata per mancanza di test specifici. L’assenza di questo antigene eritrocitario nel gatto ricevente può essere associato alla presenza nel medesimo soggetto di anticorpi anti-Mik. Questo è vero sopratutto nei gatti gruppo A. Questi anticorpi sono responsabili di reazioni trasfusionali emolitiche acute anche in caso di trasfusioni compatibili del sistema di gruppo AB. Quindi anche in soggetti dello stesso gruppo, se vi è presenza di questi anticorpi si potranno manifestare reazioni di emolisi ed agglutinazione Major e minor.

E’ sempre raccomandato?

Effettivamente nelle trasfusioni effettuate tramite sacca, piuttosto che tramite donatore, se presenti emazie come concentrati privi di plasma, cioè sospese in una soluzione salina e al mannitolo utili al mantenimento della pressione osmotica, viene a decadere il concetto di cross match, sarà possibile effettuare la sola prova major, ovvero la capacità del ricevente di emolizzare la donazione.

Esecuzione del test; cross matching major e minor Si effettuerà un prelievo in provetta con anticoagulante Tris EDTA dal donatore e dal ricevente e un prelievo in una provetta da siero dal donatore e dal ricevente (min 2 ml per prelievo), può essere sufficiente anche il solo Tris EDTA.

• centrifugare a 1000 rpm x 5-10 min. 2 ml di sangue intero (senza anticoagulante) del donatore e del ricevente (per ottenere siero), metterlo da parte, in una provetta previa identificazione. Centrifugare, a 1000 rpm x 5-10 min. la provetta con EDTA del donatore e ricevente per ottenere un sedimento costituito da eritrociti.

NB se abbiamo deciso di operare con il solo prelievo di EDTA sarà il plasma surnatante della provetta EDTA ad essere conservato per la cross reazione e sarà consigliabile un prelievo da 2,5 ml, se invece abbiamo optato per la doppia provetta questo potrà essere gettato.

• Creare una sospensione al 4% di emazie con 4,8 ml di soluzione salina (NaCl 0,9%) e 0,2 ml di eritrociti precedentemente centrifugati.

• Centrifugare, eliminare il surnatante e aggiungere nuovamente soluzione salina (4,8 ml). Ripetere il lavaggio per tre volte.

• Per evitare la formazione di rouleaux al termine dei lavaggi risospendere i globuli rossi lavati fino ad ottenere una sospensione di eritrociti al 4%, come su.

Compatibilità MAJOR, MINOR e allestimento del controllo in provetta

• MAJOR: Miscelare 2 gocce di siero/plasma del ricevente ( 1 goccia corrisponde a circa 50 microlitri per chi possiede delle pipettatrici ) con 1 goccia di eritrociti del donatore in una provetta.
• MINOR: 1 goccia di eritrociti ricevente + 2 gocce di siero/plasma del donatore in provetta.
• Allestire contemporaneamente dei controlli
• Controllo ricevente: 1 goccia di eritrociti del ricevente + 2 gocce del siero del ricevente.
• Controllo donatore: 1 goccia di eritrociti del donatore + 2 gocce di siero del donatore.
• NB il controllo deve essere necessariamente negativo; una reazione tra emazie e siero/plasma dello stesso soggetto deve essere per forza considerato invalidante il test. Un autoagglutinazione nel ricevente potrebbe essere suggestiva di anemia emolitica immunomediata.

Incubazione il cross match major e minor può essere posto in una eppendorf o altra provetta ad incubare a 37° C per 10-15 min.

Interpretazione dei risultati Osservare il colore del siero ad occhio per evidenziare la presenza di emolisi. Disporre, su vetrino portaoggetti, una o due gocce di sospensione siero/plasma con eritrociti dalle provette precedentemente incubate. Se c’è agglutinazione già ad occhio nudo sarà possibile distinguere la formazione di flocculi di emazie, è consigliabile anche l’osservazione al microscopio per l’identificazione di un’eventuale agglutinazione. Per meglio interpretare e comprendere il risultato delle prove allego una pubblicazione dell’AIVPA dove troverete in fig. 5 due prove positive e due negative. Anche se la pubblicazione è dedicata alla medicina trasfusionale del cane non cambiano i criteri interpretativi, in quanto la prova è ripetibile anche per i cani e gli effetti di una eventuale incompatibilità sono del tutto sovrapponibili. Inoltre noterete che l’agglutinazione nel primo vetrino di sinistra è meno marcata e potrebbe essere confusa con dei semplici rouleax, per questo motivo torno a sottolineare l’opportunità di un’osservazione microscopica.

Se compatibile: gli eritrociti formano una sospensione omogenea del tutto simile al sangue normale.

Se incompatibile: Si evidenzierà emolisi o agglutinazione degli eritrociti.

NOTE CONCLUSIVE: La positività della prova major indicherà la capacità del plasma del ricevente di emolizzare le emazie del donatore, la positività della prova minor indicherà la capacità del plasma del donatore di emolizzare le emazie del ricevente. La positività della prova major non implica la contemporanea positività della prova minor e viceversa.

Non confondere i rouleax con l’agglutinazione! nei primi le emazie sono impilate in colonna nelle seconde si trovano ammassate in formazioni globulari, tondeggianti.

EXTRA nel gatto anche la prima trasfusione può portare reazioni emolitiche importanti e letali