Focus

Colorazione di Papanicolaou

La colorazione di Papanicolaou, usata in citologia è utile soprattutto per lo studio delle cellule epiteliali, infatti è per gli strisci cervico-vaginali che George Papanicolaou introdusse questa colorazione (Pap test). La colorazione di Papanicolau è una colorazione di tipo tricromica

Applicazioni

  • Campioni ginecologici
  • Espettorato
  • Urina
  • Agoaspirati, (FNAB, fine needleaspiration biopsy agobiopsia con ago sottile) da organi diversi
  • Essudati
  • Lavaggi.

Risultati

  • Citoplasma:
    • Cianofilo (basofilo) Blu; verde intenso
    • Eosinofilo (acidofilo) Rosa
    • Cheratinizzato Rosa arancio
  • Eritrociti: Rosso
  • Nuclei: Blu nero; violetto scuro

Principio della colorazione di Papanicolaou

Come detto la colorazione di Papanicolaou è di tipo multicromica ed è basata sull’utilizzo di più coloranti

  • Ematossilina
  • Orange G
  • Eosina
  • Verde Luce

in 3 soluzioni.

  • colorazione nucleare (ematossilina)
  • OG-6 (Orange G)
  • EA (Eosina e Verde Luce)

L’Ematossilina è il colorante nucleare

OG6 conferisce al citoplasma una colorazione dall’arancio brillante al giallo

L’eosina invece conferisce al citoplasma delle cellule pavimentose mature e superficiali una colorazione rosa; questa colorazione mette in risalto il carattere eosinofilo delle cellule cheratinizzate.

Il Verde Luce colora il citoplasma delle cellule basali e parabasali (cianofile), povere di cheratina e conferisce una colorazione verde-celeste.

La colorazione di Papanicolaou fornisce ottimi dettagli e contrasti cromatici della struttura nucleare. In oltre questa colorazione garantisce una sufficiente trasparenza del citoplasma e delle peculiari tonalità cromatiche tipiche degli stadi cellulari siano essi fisiologici e patologici(compresi gli inclusi)

dettaglio cromatico della cheratina
Colorazione Papanicolau su cellule epiteliali

Tutto ciò permette uno studio importante delle condizioni neoplastiche e flogistiche, anche associate a batteri e virus (HPV) .

PRO

Questa colorazione permette di apprezzare la fase di maturazione delle cellule, di identificare alterazioni dovute ad infezioni batteriche o virali e di valutare la predisposizione allo sviluppo del cancro.

CONTRO

La colorazione di Papanicolaou può avere procedure lunghe e complesse, ed è per ovviare a questo che sono state sviluppate formulazioni fast che hanno tempi e modi di lavoro più semplici; questo comporta una maggiore fruibilità della colorazione e un ausilio in diagnostica. Resta di fondamentale importanza la preparazione del citologo

Richiedi un campione

colorazione rapida con alcool (tempo min 2:30″ max 4 min.)

Metodo

  1. Immergere rapidamente 10-15 volte in soluzione fisiologica per un secondo i vetrini, precedentemente fissati all’aria.
  2. Passare rapidamente in immersione per 10-15 volte in alcool 96°
  3. immergere il vetrino nella suluzione 1 per 30-60 sec.
  4. sciacquare per 10 sec con acqua di fonte
  5. immergere per 20-30″ in Blue water
  6. sciacquare con 6 rapidi passaggi in acqua di fonte
  7. 8-10 immersioni rapide in alcool a 96°
  8. immergere il vetrino nella suluzione 2 per 30-60 sec.
  9. immergere rapidamente 10-15 volte in alcool 96°

colorazione rapida senza alcool

Metodo

  1. Vetrini fissati all’aria passaggio uno
  2. Colorare i nuclei con ematossilina per 2-5 minuti.
  3. Risciacquare rapidamente con acqua distillata.
  4. Acqua di Scott (blu water), 3-5 minuti.
  5. Risciacquare con acqua distillata.
  6. Golding soluzione di colorazione per 2-5 minuti.
  7. Risciacquare rapidamente con acqua distillata.
  8. Disidratare rapidamente con etanolo.

A questo link potete trovare informazioni per chi vuole approfondire

Colorazioni di May Grünwald-Wright-Giemsa

Le colorazioni di May Grünwald-Wright-Giemsa sono tecniche di colorazione tipo Romanovsky, cioè metacromatiche differenziali. Queste possono essere usate separatamente o come May Grünwald -Giemsa e o Wright-Giemsa.

La base è sempre costituita dal blu di metilene e eosina e una soluzione alcolica, a queste si può aggiungere uno dei tre coloranti May Grünwald-Wright-Giemsa, oppure questi possono essere usati come coloranti unici. In questo caso prevedono i coloranti di base in un’unica soluzione alcolica . ES. la soluzione di Giemsa, è una miscela complessa, costituita da blu di metilene cloruro, blu di
metilene eosinato, azurro II eosinato. (soluzione alcolica completa)

USO

Le colorazioni di May Grünwald-Wright-Giemsa sono indicati soprattutto per lo studio parassitologico e citologico di campioni ematici e linfatici, fecali, (liquido duodenale e chilo) liquido cerebrospinale, delle sierose e del reticolo endoteliale

In generale una colorazione standard richiede circa 30 min, per questo si può presentare di difficile utilizzo nella pratica ambulatoriale, soprattutto per flussi di lavoro notevoli.

Caratteristiche prestazionali

I nuclei assumeranno svariate tonalità di viola. Il colore del citoplasma sarà di varie gradazioni, dal blu al rosa pallido. Nel citoplasma di alcuni tipi di cellule potrebbero comparire alcuni granuli dal rossiccio al lilla. I basofili saranno caratterizzati dalla presenza di granuli tra il blu scuro e il nero nel citoplasma. Gli eosinofili saranno caratterizzati dalla presenza di granuli di color arancione vivo nel citoplasma. I globuli rossi dovrebbero assumere un colore tra il rosa e l’arancione.

Questi coloranti in modo angolo al Diff Quick sono utili all’identificazione dei trofozoiti del Phylum Apicomplexa oltre parassiti fecali ed emoparassiti. Meno adeguati sono all’identificazione delle forme cistiche.

  • Dientamoeba fragilis
  • Pneumocystis
  • Plasmodium falciparum
  • Toxoplasma
  • Flagellati
  • Microsporidi
  • Epatozoon
  • Piroplasmi

Bisogna comunque precisare che per le oocisti di coccidi come Cyclospora, Isospora, Sarcocystis, Toxoplasma e per uno studio più approfondito del materiale fecale è preferibile utilizzare e/o affiancare altre colorazioni, che possono implementare lo studio di Apicomplexa anche nelle sue forme cisitiche.

Interpretazione

le cellule appariranno di colore azzurro o azzurro-grigi per il citoplasma e rosso-porpora viola per il nucleo.

La soluzione di May Grünwald, costituita da eosinato di blu di metilene che colora i nuclei in blu ed il citoplasma basofilo in rosso-rosa La soluzione di Giemsa, aumenta l’intensità della colorazione nucleare e la capacità di evidenziare selettivamente gli elementi cellulari e il reticolo endoplasmatico

Pro

Coloranti che permettono un buono studio citologico e dei parassiti associati a diversi campioni

Contro

Le colorazioni di May Grünwald-Wright-Giemsa sono piuttosto complesse da gestire sia a livello di sicurezza (tossicità), oltre che di metodo. I tempi id colorazione possono arrivare a oltre 35 minuti.

E’ preferibile usare il Diff Quick per sfruttare questo tipo di colorazione, più altre colorazioni non differenziali per integrare lo spettro analitico.

Richiedi un campione

Siamo in grado di fornire un kit di colorazione rapida tipo Giemsa, con la seguente procedura, richiedi un campione grtuito

Metodo Giemsa rapido

  1. Dopo avere asciugato all’aria lo striscio di sangue, immergerlo nella soluzione di Giemsa non diluita per 5–6 minuti.
  2. Immergere in acqua deionizzata per 2–4 minuti, in base alle proprie preferenze di colore.
  3. Sciacquare in acqua deionizzata.
  4. Asciugare all’aria ed esaminare al microscopio.

Oppure la colorazione standard

Metodo Giemsa standard

  1. Fissare i vetrini in metanolo per 5–7 minuti.
  2. Asciugare all’aria.
  3. Diluire la colorazione di Giemsa con tampone a pH 7,2 rapporto 1:20. È possibile apportare modifiche alla tonalità del colore diluendo con il tampone.
  4. Colorare la pellicola per 20–30 minuti.
  5. Sciacquare in acqua deionizzata.
  6. Asciugare all’aria ed esaminare al microscopio.

NB Nella valutazione dei risultati va ricordato che: il quadro cromatico è
fortemente influenzato dal pH delle acque di lavaggio e del tampone di diluizione; l’intensità della colorazione può
variare in funzione dei tempi di differenziazione. TUTTE LE SOLUZIONI SONO FORNITE, subito pronti al lavoro.

Diff Quick Stain

CARATTERISTICHE

Il Diff Quick Stain è una colorazione rapida tipo Romanowsky, ovvero metacromatica. La metacromasia si esprime con una gamma di variazioni cromatiche che rendono le colorazioni come il Diff Quick di tipo differenziale. Per la rapidità e la facilità di utilizzo il Diff Quick è la colorazione differenziale più usata.

I coloranti come May Grunwald/Giemesa/Wright rappresentano altri tipi di colorazioni Romanovsky.

.E’ costituito da due coloranti e un fissativo alcoolico.

  • Fissativo alcolico
  • Eosina acida ad affinità con elementi basici che appaiono dal rosa al viola (metacromasia).
  • Blu di metilene basico ad affinità con acidi nucleici che appunto appaiono blu

E’ importante sottolineare che questo tipo di colorante è maggiormente indicato per elementi citoplasmatici ed extracellualri come

  • mucine citolpasmatiche e extracellulari
  • goccioline di grasso
  • granuli neurosecretori
  • colloide
  • sostanza fondamentale

La variabilità chimica e le caratteristiche di pH legate alle qualità anfotere delle proteine, permette l’espressione delle caratteristiche metacromatiche.

il nucleo si colora in viola/porpora, ma con pochi contrasti, il citoplasma si colora in blu/celeste/grigio, tuttavia campioni diversi possono presentare colorazioni e tonalità differenti. Ad ogni modo come è stato detto, il blu e il rosso restano i colori fondamentali di questa colorazione.

PRO

il DIFF QUICK, come indica la parola stessa rappresenta un METODO RAPIDO E PRATICO di colorazione tipo Romanowsky. Si effettua in pochi e semplici passaggi, non sono richieste particolari precauzioni.

  • ottimo colorante per l’ematologia
  • su strisci ematici è inoltre possibile evidenziare #Nematodi, #Mycoplasmi e parassiti appartenenti al Phylum #Apicomplexa
  • E’ un ottimo colorante per la citologia (soprattutto per la valutazione del citoplasma) e una colorazione, anche per una valutazione preliminare della qualità del campione, non può prescindere da questo colorante.

CONTRO

  • Incompleto per la citologia. E’ preferibile affiancare altre colorazioni.
  • Praticamente del tutto inadeguato in microbiologia: In un campione citologico purulento, può aiutarci ad identificare neutrofili in fagocitosi verso batteri o neutrofili con caratteristiche di degenerazione, anche settica, ma in nessun modo potrà fornirci dati accurati sulla specie in questione se non una grossolana distinzione tra cocchi e bastoncelli

UTILIZZO

Semplice da usare, dopo aver strisciato il campione su vetrino e fatto essiccare questo si immerge nella prima soluzione alcolica

  • Immergere il vetrino 5 volte per 1-2 secondi nella soluzione fissativa alcolica. Attendere che l’alcol evapori
  • Immergere il vetrino 5 volte per 1-2 secondi nella soluzione rossa. Inclinare il vetrino e attendere un istante per eliminare l’eccesso.
  • Immergere il vetrino 5 volte per 1-2 secondi nella soluzione blu. Inclinare il vetrino e attendere un istante per eliminare l’eccesso.
  • Lavaggio con acqua
  • Si lascia asciugare il vetrino all’aria.

Fare attenzione ai contenitori dove si ripongono ed usano i coloranti che siano chiudibili ermeticamente, soprattutto il blu tende ad ossidarsi e a perdere le proprie caratteristiche di colorante

Diff Quick Stain
coloranti contenuti in contenitori ermetici, primo da sinistra alcol, seguono eosina, blu di metilene e facoltativamente un contenitore con acqua distillata per il risciacquo

per informazioni commerciali e tecniche contattaci

Coloranti e colorazioni in citologia

La conoscenza dei coloranti e delle colorazioni diagnostiche e delle loro caratteristiche, può essere molto utile in laboratorio, per di più in una disciplina poco esatta come la citologia. In altre parole comprendere le loro caratteristiche e le modalità di utilizzo, sarà di aiuto nello studio e nella caratterizzazione dei campioni.

Al fine di perseguire questi obiettivi si tratterà particolarmente di alcune caratteristiche salienti

  • pregi e difetti per il campione studiato
  • facilità di utilizzo
  • economia dei prodotti

E’ importante sottolineare che lo stesso principio di colorazione può avere metodiche applicative e risultati diversi. In altre parole ogni produttore, in fase di produzione può conferire caratteristiche uniche allo stesso tipo di colorante.

Livelli di Proteina C reattiva in conigli con sospetta infezione da Encefalitozoon cuniculi


Lo scopo di questo studio è una valutazione primaria e comparativa della Proteina C reattiva (PCR), rispetto all’aptoglobina (HP), amiloide sierica (SAA) come indicatori diagnostici di animali siero positivi per Encefalitozoon cuniculi.
Potete trovare la versione originale di questa pubblicazione al seguente indirizzo . La seguente è una mia traduzione e forma sintetica, dello studio.

Caratteristiche generali dello studio

Segni clinici e risposta alla terapia per Encefalitozoonosi sono stati i parametri discriminanti di questo studio al fine di dividere un campione di 48 conigli in 2 gruppi “sospetti (ECUN)e non sospetti (NECUN)” (malati) di Encefalitozoonosi. In base a queste caratteristiche, 19 sono stati giudicati non sospetti, mentre 29 come sospetti. La titolazione delle IGg per valutare lo stato dell’immunità verso il parassita, è stata eseguita con metodo ELISA. E’ importante sottolineare che la suddivisione ECUN/NECUN, non è stata assegnata dai valori di sieropositività ricavati, in quanto elevati titoli anticorpali si possono rilevare in soggetti con infezione clinicamente evidente, nei soggetti con infezione sub-clinica e soprattutto in soggetti sani.

Considerazioni statistiche sul campione

I criteri stitistici e clinici di inclusione nei gruppi ECUN/NECUN, hanno trascurato parametri clinici e diagnostici come;

  • Presentazione temporale dei soggetti in momenti clinici diversi.
  • Non sono state prese in considerazione altre possibili patologie concomitanti.
  • Non vi è una distinzione per età e razza.
  • Ma ancora più importante è che la maggior parte dei soggetti sospetti erano affetti da forme neurologiche, da un lato in queste forme la PCR potrebbe avere un regolazione differente, rispetto alle forme renali e oculari ed è proprio nei soggetti con manifestazioni neurologiche che la PCR si è dimostrata più performante.

Quindi secondo gli stessi autori, in virtù delle premesse e dei punti su elencati, l’interpretazione dei valori di PCR all’ausilio nella diagnosi potrebbe essere sovrastimata. Lo studio della PCR si è dimostrata utile nell’interpretazione dei casi con elevate concentrazioni di IGg.

Valutazione dei titoli anticorpali rispetto alla clinica

  • Il titolo anticorpale da solo non può essere sufficiente per la diagnosi di malattia. (vedi caratteristiche generali dello studio)
  • la mancanza di anticorpi al contrario può escludere l’infezione in soggetti con sintomatologia.
  • I soggetti considerati positivi hanno mostrato un titolo anticorpale medio di 1:1324, 1,7 volte + alto dei clinicamente sani e non sospetti di malattia, il titolo medio anticorpale di questi ultimi è risultato essere 1:700, o poco superiore.
  • Le gammaglobuline IGg hanno un’emivita molto lunga, per questa inerzia nella modificazione dei titoli poco indicativa dello stato clinico dell’animale

Livelli di PCR e comparazione con altre proteine di fase acuta e gamma globuline nei soggetti considerati sospetti

  • Di 29 conigli (sospetti)  17 (58.6%) dimostravano livelli CRP superiori a 20 mg/L.  6 soggetti (20.7%) avevano concentrazioni superiori  100 mg/L.
  • Per HP e SAA i valori non hanno mostrato differenze significative tra i soggetti testati.
  • 3 di 4 conigli con sintomatologia neurologica classica mostravano elevati livelli di IGg.
  • I livelli più elevati di gammaglobuline si hanno nei soggetti con sintomatologia neurologica, i soggetti classificati come sospetti ma con sintomatologia diversa da quella neurologica hanno mostrato titoli anticorpali più vicini ai non sospetti.
  • I livelli di PCR medi associati ai sospetti  vanno da 30 a 200
    mg/L
  • I soggetti con valori molto alti hanno mostrato oltre l’infezione encefalica anche iperplasia e fibrosi epatica e una condizione patologica grave, che li ha condotti all’eutanasia.
  • I casi in cui i sospetti hanno presentato valori normali di PCR possono essere spiegati  dal breve periodo di latenza intercorso tra segni clinici e presentazione alla visita, la PCR ha bisogno di 24 ore per incrementare il suo valore in seguito ad un insulto  infiammatorio., oppure la competenza del sistema immunitario nella contenzione dell’infezione dal E. cuniculi ha dato una downregolation della PCR. 
  • L’aptoglobina è un buon marker per le infezioni ad andamento cronico, quindi discrepante rispetto alle caratteristiche cliniche di questa patologia e a questo studio.
  • La SAA in realtà non ha una metodica validata rispetto a questa specie, altri studi potrebbero abilitare la SAA come marcatore efficace per stadi infettivi acuti nel coniglio ( elevati livelli di SAA si sono manifestati solo nel soggetto con PCR superiore a 600 e con lesioni al fegato)

Alcuni valori di comparazione diagnostica/clinica tra gruppi di sospetti (ECUN) e non sospetti (NECUN)

Table 2. Select cases of suspected or confirmed ECUN infection

Caso       PCR mg/L   Titolo IgG          Segni clinici Informazioni/Diagnosi

1               44.6           1:1024 Neurologico/convulsioni Necropia/Sospetto ECUN

2 72.2           1:128   Neurologico—head tilt Terapia efficacie/Sospetto ECUN

3               175.5         1:1024 Neurologico—head tilt Terapia efficacie/Sospetto ECUN

4               621.2         1:1024 Neurologico—head tilt/atassia Necropia/Sospetto ECUN

5               6.3              1:128    Neurologico—head tilt NECUN/Diagnosi di otite media

6               2.0           negative Neurologico—head tilt NECUN/Diagnosi otite cronica

7             9.9              1:128 Uveite Istopatologia positiva/Spore Isolate

8               3.0              1:128 Oculare NECUN/Diagnosi di cataratta

9               21.1            1:512 Renale—PU/PD Terapia efficacie

10             60.4           1:4096 Renale—PU/PD Terapia efficacie

11             19.4           1:256 Renale—incontinenza NECUN/Patologie del tratto urinario

12              6.4         negative   Renale—incontinenza NECUN/Diagnosi di cistite

13              2.3            1:512    Nessuno Clinicamente normale

14              3.9            1:4096   Nessuno Clinicamente normale

15              19.4          1:256    Nessuno Clinicamente normale

Cosiderazioni finali sintetiche

Si evince che i valori più elevati di PCR sono associati alle forme neurologiche* di Encefalitozoonosi. Le forme non neuroligiche di Encefalitozoonosi mostrano livelli di PCR con valori di poco superiori il range. In questo studio inoltre la PCR sembra essere poco utile nelle forme morbose infiammatorie non sostenute da E. cunculi.

*Per ammissione degli stessi autori la struttura dello studio potrebbe sovrastimare la determinazione dei valori di PCR nelle patologie neurologiche sostenute da E. cuniculi.

Flottazione fecale in centrifugazione e miniflotac


La flottazione fecale consiste sostanzialmente in un processo di arricchimento del campione. Questo arricchimento sarà sensibilmente migliorato da un processo di centrifugazione.
La scelta della soluzione flottante è determinata dal tipo di parassita che vogliamo isolare. Le soluzioni sono molteplici, qui prenderemo in considerazione le più usate.

Soluzioni flottanti di uso comune

  • Nitrato di sodio o cloruro di sodio è utile nell’identificazione delle uova di elminti ma scarsamente utile per l’identificazione dei protozoi eccezion fatta per le cisti di coccidi. Occasionalmente con l’uso di questa soluzione si possono osservare trofozoiti di Giardia che normalmente potrebbero essere lisati in questa soluzione.
  • Solfato di zinco è la soluzione flottante ad alto PS più utilizzata e particolarmente indicata per l’isolamento di larve di strongili e per gli altri parassiti. Sconsiglio il Solfato di Zinco perché costoso e di non facile reperibilità, inquinante e può alterare la struttura dei parassiti a causa dell’elevata pressione osmotica della soluzione.
  • Soluzione zuccherina di Sheather presenta le stesse caratteristiche in termini di peso specifico ma è più viscosa, caratteristica che non permette ai detriti di salire in superficie favorendo la lettura del campione (e in alcuni esami delle feci questo non è un dettaglio da poco)
    E’ inoltre totalmente biodegradabile (fatta eccezione per un piccolo quantitativo di formalina)
    Ha una bassa pressione osmotica rispetto alle soluzioni ad alto peso specifico, lasciando inalterate le strutture dei parassiti
    Di facile preparazione anche in ambulatorio.
    E’ particolarmente indicata per l’isolamento di protozoi e anche di larve di strongili e uova di parassiti.

Procedura di flottazione

  • In una provetta falcon si introducono 8-10 ml di acqua e 1-2 grammi di feci
  • Mescolare bene e porre la provetta in centrifuga a 1500 g per 5 minuti gettare via il surnatante, rovesciando la provetta. (ripetendo più volte questa operazione di centrifuga con acqua si otterranno feci più chiare)
  • Aggiungere 7-8 ml di soluzione flottante
  • Miscelare bene
  • Centrifugare a 1500 g per 5 minuti
  • Aspirare con una pipetta una piccola parte di surnatante (una goccia o poco più) in prossimità del contatto del liquido con la parete della provetta e apporla su di un vetrino.
  • Coprire con vetrino copri oggetto e osservare
provetta per esame delle feci

La provetta Falcon è particolarmente indicata per la parassitologia, in quanto nel fondo conico si raccoglie il sedimento e il fatto che sia graduata aiuta nell’aggiunta delle soluzioni.

Secondo la mia esperienza una flottazione con centrifugazione può rendere positivo, anche se debolmente, un campione che con flottazione in soluzione salina semplice risulterebbe negativo. L’uso di soluzioni flottanti con peso specifico superiore alla salina, in fase di centrifugazione, può svelare una concentrazione fecale del parassita fino a 50 volte superiore ad una flottazione tradizionale .

Uso del miflotac

Per implementare la sensibilità della procedura di arricchimento e la velocità di esecuzione consiglio l’utilizzo del mini flotac. Il flotac è stato concepito ed è acquistabile presso l’Università di medicina Veterinaria di Napoli, naturalmente anche on line.

Risulta costituito da un fill flotac sulla sinistra, che funge da omogenizzatore, in questo andremo ad introdurre le feci e l’acqua. Una volta omogenizzate si verserà il contenuto in due falcon (10 ml circa in ogni provetta). A questo punto si procederà come descritto su, nella procedura di flottazione con centrifuga:

  • In una provetta falcon si introducono 8-10 ml di acqua e 1-2 grammi di feci
  • Mescolare bene e porre la provetta in centrifuga a 1500 g per 5 minuti gettare via il surnatante, rovesciando la provetta. (ripetendo più volte questa operazione di centrifuga con acqua si otterranno feci più chiare)
  • Aggiungere 7-8 ml di soluzione flottante
  • Miscelare bene
  • Centrifugare a 1500 g per 5 minuti
  • Aspirare con una pipetta una piccola parte di surnatante (circa 2 ml) in prossimità del contatto del liquido con la parete della provetta e apporla nel pozzetto di lettura del mini flotac.
  • una volta depositato il contenuto si possono aspettare altri 10 min. di flottazione semplice oppure procedere con la traslazione del coperchio e procedere alla lettura

Sito suggerito dotato di molte immagini ottimo per lo studio.

Esame coprologico a fresco per la ricerca di protozoi intestinali.

L’esame coprologico a fresco è un metodo rapido ed efficacie per la ricerca di protozoi intestinali (Trofozoiti), ma questo deve essere eseguito entro 30 min. causa incistamento dei parassiti.

  • Entro trenta minuti sarà possibile osservare i trofozoiti protozoari.
  • Nei campioni stoccati e conservati questi possono subire lisi o andare incontro a incistamento (cisti e oocisti) e non essere più visibili come tali.

Metodi

Striscio diretto

L’esame coprologico a fresco, deve ovviamente essere svolto in tempi rapidi e proprio per questo presso la propria struttura, Bisogna quindi essere in grado di saper riconoscere autonomamente le varie forme protozoarie. I campioni diarroici rendono questo esame ancora più indicato.

Tecnica di preparazione

  • Bisogna apporre una goccia di soluzione fisiologica su un vetrino porta oggetti nella quale andremo a stemperare una minima quantità di feci (poco più di una lenticchia), una quantità elevata di feci potrebbe far perdere la trasparenza necessaria all’osservazione del campione.
  • Sul materiale preparato andremo ad apporre un vetrino copri oggetti
  • L’osservazione sarà tramite obbiettivi 10X e 40X (per migliorare l’osservazione di paradditi come Giardia e Cryptosporidium è consigliato il 40x)
  • Per migliorare l’osservazione il microscopio deve essere impostato in modo da fornire il massimo contrasto possibile. (chiudere in maniera adeguata il diaframma del microscopio)
Il condensatore si trova al di sotto del tavolino traslatore portaoggetti. Sulla sinistra è visibile una vite che regola la distanza della lente dal piano di fuoco in questo modo possiamo avere un campo più o meno illuminato. Sulla Destra è presente una leva inclinata verso il basso che ci premetterà, tramite traslazione orizzontale di aprire o chiudere il diaframma regolando il contrasto.
Un Diaframma più chiuso è indicato per gli obiettivi con ingrandimento minore Es. 10x
Ruotando la leva si avrà il diaframma aperto. Man mano che si sale con con la profondità di campo (fino a 100x) bisogna allargare il diaframma altrimenti il campo apparirà scuro

Tabella per lo studio morfologico dei parassiti
(le tabelle sono tratte da Malattie infettive del cane e del gatto. Malattie batteriche e protozoarie Copertina rigida – 31 ago 2008 di Graig E. Greene)



Parassita
Procedura Morfologia
a fresco

Balantidium coli

Trofozoiti
Striscio
diretto
-Forma ovale
-Movimento
circolare sul
proprio asse tramite cilia
-Può essere visibile un
micronucleo.

Cisti
 
Flottazione
dopo
centrifugazione
in solfato di Zn

Coccidia
-Toxoplasma -Isospora -Sarcocystis -Hammondia -Besnoitia –Cryptosporidium
Oocisti Flottazione
dopo
centrifugazione
con soluzione di
Sheater
 

Entamoeba
histolytica
Trofozoiti Striscio
diretto
-Cambia forma
quando è attivo, -Si muove per
mezzo di
protrusioni del
citoplasma.

Cisti

Striscio
diretto  

Giardia
Trofozoiti -Striscio diretto
-Occasionalmen te osservati in
flottazione
-Simmetrico
bilateralmente
con 2 nuclei divisi
dall’asse mediano
-Di forma periforme
-Movimenti rollanti
per mezzo di
flagelli

Cisti
 
-Striscio diretto
-Flottazione
dopo
centrifugazion in solfato di Zn o soluzione
zuccherina

Trichomonas
Trofozoiti Striscio diretto -Movimenti
rapidi e sinuosi
e a scatti per
mezzo di flagelli

Colorazione dello striscio diretto

Per facilitare la lettura dell’esame coprologico a fresco è possibile aggiungere una goccia di colorante, prima di apporvi il vetrino coprioggetti. In tal modo la visione delle strutture dei protozoi intestinali risulterà facilitata.

Tabella delle colorazioni per lo studio morfologico dei parassiti

Colorante Parassita Effetto sul preparato e il
parassita



Iodio
(soluzione
di Lugol)





Colorazione conDiff Quick
(Gimsea simile)




Giardia










-Colora il citoplasma delle
cisti color oro
-Il nucleo rimane
rifrangente e chiaro
-È possibile evidenziare
anche i trofozoiti che
appariranno con due nuclei e corpuscoli mediani

Aspetto trofozoiti con
colorazione


Blu di
metilene
(in generale
utile per
l’identificazione di trofozoiti)
Hentamoeba
histolytica
Il nucleo ha una
distribuzione
periferica di
cromatina e un
compatto cariosoma
centrale
Verde di metile Balantidium
coli
-Colora il macronucleo che ha forma di semiluna
-Può essere
presente un micronucleo
Eosina
acquosa

Cristal
violetto
Questi colorati non colorano direttamente
il parassita
ma lo sfondo
lasciando i parassiti
trasparenti in risalto
Questa immagine ha l'attributo alt vuoto; il nome del file è giardia2.jpg

Cisti di Giardia non colorate. Senza la colorazione per un occhio inesperto è più facile confondere una ciste con i detriti fecali.
Risultati immagini per trofozoiti di giardia

2 cisti Giardia al centro del campo. La colorazione mette in evidenza i nuclei e le strutture interne. Fonte

Sito suggerito dotato di molte immagini ottimo per la consultazione in fase di analisi.

Infine bisogna precisare che il settaggio del microscopio può fare la differenza nell’isolamento dei Protozoi. Vi rimando a questo sito per un rapido refresh sulle caratteristiche tecniche del microscopio.

Coprocoltura nel cane e nel gatto

Quando è utile?

COPROCOLTURA nel cane e nel gatto

Si esegue preferibilmente in animali che presentano una sintomatologia gastrointestinale acuta, di diarrea del tenue, del crasso o mista.

La copro coltura è consigliata nei soggetti con diarrea anche emorragica con piressia e o leucogramma di tipo infiammatorio, oppure per la presenza di neutrofili all’esame citologico delle feci.

Bisogna precisare che la popolazione microbica fecale sulla quale andremo ad effettuare l’esame è in pratica rappresentativa della sola componente colica, in quanto la popolazione dell’intestino tenue è scarsamente rappresentata.

La ricerca degli agenti patogeni deve essere correlata alla sintomatologia clinica.

Una coprocoltura per alcuni versi può risultare paradossale;

  1. Perchè è l’analisi di un campione che sappiamo già essere positivo, perché normalmente ricco di batteri, con diverse esigenze colturali ma che nell’intestino crasso trovano un’habitat comune. In vitro utilizzeremo queste differenze per un’isolamento mirato.
  2. Un altro paradosso è che con discreta probabilità isoleremo i batteri patogeni che cerchiamo, senza che questi siano responsabili di patologia (es E. coli, Enterococchi) quindi; l’interpretazione e lo studio dei risultati insieme alla tecnica di isolamento e ai dati clinici e anamnestici costituiscono tre step fondamentali.

Con l’esame coprologico andremo ad isolare Campylobacter, E. coli, Salmonelle, Clostridi, davvero un ristretto numero rispetto alla complessità del microbioma intestinale.


Salmonella

Vari siero gruppi di Salmonella costituiscono la flora commensale di rettili e volatili. Nei mammiferi domestici e più particolarmente nel cane e gatto l’isolamento si riduce ad un reperto poco più che occasionale (la maggior parte degli autori la attesta al 2% circa) e può essere influenzata dalla dieta a base di carne cruda o poco cotta, magari con carne di pollame. L’isolamento richiede terreni selettivi e appositi test biochimici e/o prove sierologiche sono necessarie per la tipizzazione e la valutazione del sierotipo per valutare il grado di patogenicità, che insieme alla valutazione della carica batterica e come già sottolineato, ai dati anamnestici, possono essere un criterio valido ma non sempre sufficiente alla diagnosi di Salmonellosi. Inoltre sono necessarie tre coprocolture perché i campioni possano considerarsi negativi per Salmonella, con un intervallo di confidenza del 90%.

Salmonella può richiedere una particolare cura nel trasporto, in quanto mal sopporta condizioni di acidità che potrebbero crearsi nel trasporto delle feci raccolte. Per ovviare a tale inconveniente si possono stemperare le feci con un po di ringer lattato, oppure usare terreni Amies con carbone prima di inviarle al laboratorio.

Per meglio comprendere la patogenicità di Salmonella è necessario definirne gli aspetti tassonomici e microbiologici. Le Salmonelle sono batteri che infettano e vivono come commensali in una vasta gamma di animali da quelli a sangue caldo a quelli a sangue freddo, perfino insetti. Per la loro distinzione e comprensione del grado di patogenicità è indispensabile una classificazione. Questa sarà indispensabile per la classificazione dei sierotipi. La classificazione prevede la tipizzazione dell’antigene somatico O e flagellare H, tramite prove di siero agglutinazione.

Alcune specie di Salmonella sembrano essere specie specifiche in quanto si isolano con costanza dalle stesse specie animali.

ES: di sierotipi di Salmonella con specificità di ospite

  • abortus equis e ovis rispettivamente da cavalli e ovini
  • dublin nei bovini
  • pollorum e gallinarum nel pollame
  • choleraesuis nei suini

Raramente choleraesuis e dublin provocano malattia nell’uomo e in altri animali. I rimanenti sierotipi di Salmeonella non mostrano specificità d’ospite e sono ugualmente patogeni per diverse specie animali. Le Salmonelle possono avere un diverso grado di virulenza e la capacità di causare patologie varia da semplici forme enteriche a malattie sistemiche come il tifo causato da Salmonella thypi, che tuttavia non risulta particolarmente patogena per gli animali. La Salmonella maggiormente isolata dagli animali e uomini malati è la typhimurium.

Campylobacter

Studi condotti in Gran Bretagna riportano come dato statistico l’isolamento di Campylobacter spp nel 30 % dei campioni fecali. Campylobacter upsaliensis è il tipo maggiormente isolato nei cani con o senza sintomatologia, C. coli è stato isolato in gatti con e senza fenomeni diarroici. Allo stato dell’arte la specie con più alta patogenicità, è il C. Jejuni. Si può facilmente comprendere quanto sia importante la tipizzazione di specie, per non considerare qualsiasi positività di rilievo clinico e suscettibile di terapia antibiotica.

L’isolamento di genere è possibile con le tradizionali tecniche microbiologiche altrettanto non si può dire per la tipizzazione. Infatti per questo ulteriore step è necessaria la PCR. Un’altra problematica legata all’isolamento di Campylobacter è il trasporto del campione e alla possibilità che questo batterio arrivi in condizioni di poca vitalità alla lavorazione. Sarebbe ideale una semina che avvenga il prima possibile.

Clostridi

I Clostridi sono Batteri anaerobi Gram positivi, sporigeni. La sua importanza nelle infezioni degli animali domestici d’affezione è in questo momento amplificata, come per la medicina umana dall’uso di antibiotici e al trattamento nosocomiale degli animali. Le specie più importanti sono il C. difficile e il perfrigens.

Il C. perfrigens presenta delle caratteristiche che ne rendono particolarmente complicata la valutazione clinica in quanto un isolamento microbiologico è si possibile ma di nessun rilievo in quanto presente come commensale nella flora di cani e gatti. E’ considerato come responsabile di diarrea nosocomiale che compare poco dopo giorni dal ricovero, questo è un dato da tener presente nelle indagini per la valutazione sull’impatto clinico di questo batterio. Responsabile della diarrea è la tossina da esso prodotta, C. perfrigens Entrotoxin (CPE), che viene rilasciata in fase di sporulazione dalla distruzione del soma batterico, anche se non è sempre così.  Questa tossina è codificata dal gene cpe.

Clostridim difficile è anch’esso isolabile con una frequenza elevata in feci di cani e gatti sani e malati, le infezioni sono rare. La patogenicità del batterio si lega necessariamente  all’esotossina A e alla citotossina B, si può determinare la presenza di queste tossine con tecnica ELISA. Ma anche in questo caso la presenza delle tossine non è necessariamente legata a sintomatologia.

Aspetti diagnostici

Le indagini in PCR sono in grado di identificare con straordinaria sensibilità e specificità i genotipi dotati di gene cpe ma anche in questo caso l’informazione non è di nessuna utilità, in quanto una buona percentuale dei sani, 20% può presentare Clostridi portatori di tali geni. Un altro metodo semplice ed immediato per l’identificazione di Clostridi è la colorazione che può mettere in evidenza un buon numero di spore. Comunque queste sono rilevate anche in animali senza alcun segno clinico caratteristica che rende poco valida anche questa procedura.

Oltre quanto appena detto, non tutti i batteri in sporulazione producono tossine e la presenza della stessa e rilevata, in assenza di spore, in animali sani e malati. Metodiche ELISA per rilevare la presenza di tossine, è abbastanza sensibile ed accurata, ma il significato rimane relativo e poco utile per quanto specificato su.

Sarebbe forse utile la raccolta e il confronto di più dati, quali;

  1. l’anamnesi (tempo e modo di insorgenza della diarrea)
  2. la presenza di più di 6-7 spore ad alto ingrandimento (100X)
  3. la presenza di tossina per migliorare lo “score” diagnostico.

L’ELISA per la rilevazione di tossine, resta un test poco specifico ma la presenza di tossine in presenza di sintomatologia va sicuramente tenuto in considerazione. Ai dati su riportati va associato come dato anamnestico l’uso di antibiotici e l’insorgenza di sintomatologia in sede nosocomiale.

La PCR è sicuramente un metodo eccellente di identificazione del batterio, anche di quelli portatori di geni che producono  tossine patologiche, ma la presenza di questi genotipi non è correlata necessariamente alla patologia.

Microbiologia

In questa sezione troverete approfondimenti sugli aspetti colturali relativi ai batteri e sulla validità ed interpretazione di esame colturali a partire dai vari apparati secreti ed escreti. La presenza di flore microbiche localizzate in diversi apparati, rende non necessariamente patologica la positività di un esame colturale. Quindi ad ogni batterio isolato in diversi tamponi va assegnata un’importanza relativa ed in relazione alla sintomatologia del paziente.

I gruppi sanguigni del gatto e reazioni trasfusionali avverse

I gruppi sanguigni del sistema AB nel gatto, per quanto facilmente individuabili, non riescono a garantire una pratica trasfusionale senza reazioni avverse.

Questo sunto è tratto da Veterinaria Anno 29, n° 5, Ottobre 2015, troverete più avanti il link che vi indirizzerà all’articolo completo.

Approccio ai gruppi sanguigni del gatto

Antigeni

  • Nel gatto è riconosciuto un sistema di gruppi sanguigni basato sull’antigene A e B e antigene eritrocitario Mik
  • dominante A il più frequente soprattutto nel gatto europeo
  • recessivo B
    Il gruppo B ha una maggiore prevalenza nelle razze British Shorthair, Birmano, Devon e Cornish Rex, Abissino, Somalo, Turkish Van e Turkish Angora
  • combinazione dei 2 gruppi AB
    Il gruppo AB è molto raro è presente in gatti domestici a pelo lungo e corto e nella razza Abbissina, Birmana, British shorthair, Norvegese, Persiano, Scottish fold, Cornish rex, Devon rex, Maine Coon, Manx, Ragdoll, Sphynx, Bengalese, Egiziano e Siberiano.
  • di recente isolamento (2007) antigene eritrocitario Mik
    La diffusione purtroppo non può essere valutata per mancanza di test specifici ed è soprattutto quest’ultimo a generare reazioni trasfusionali avverse anche con compatibilità del gruppo AB.


Alloanticorpi e fiosiopatologia

Sopratutto i gatti di gruppo A possono essere provvisti di alloanticorpi (anticorpi naturali) anti Mik proprio perché privi di tale antigene. Gli anticorpi anti Mik e anti A o B nel gatto sono anticorpi preformati, naturali, detti Alloanticorpi, si formano nei primi mesi di vita e la loro formazione non richiede il contatto con gli antigeni verso i quali sono rivolti. Sono questi anticorpi che si rendono responsabili di reazioni trasfusionali avverse come l’agglutinazione e l’emolisi, anche in caso di compatibilità trasfusionale testata con i tradizionali gruppi sanguigni del sistema A e B. Per quanto detto, si intuisce facilmente che il semplice test del sistema AB non è in grado di escludere reazioni di rigetto neanche alla prima trasfusione, per questo motivo in questa specie oltre la determinazione del gruppo sanguigno andrebbe sempre eseguito il crossing match tra donatore e ricevente.

  • 1/3 dei gatti di gruppo A, possiede immunoglobuline (alloanticorpi) a basso titolo (1:2), con debole azione emolizzante rivolta nei confronti dell’antigene eritrocitario di gruppo B.
  • Tutti i soggetti di gruppo sanguigno B sono dotati di immunoglobuline (alloanticorpi) ad alto titolo (da >1:32 fino a 1:2048) con azione emolizzante (IgG e IgM) e agglutinante (IgM) nei confronti dell’antigene eritrocitario di gruppo A.
  • Gli anticorpi anti emazie non sono invece presenti nei gatti di gruppo AB.

Possibili interazioni antigene anticorpo post-trasfusionale e caratteristiche cliniche

  • I gatti A e B vanno trasfusi con i gruppi corrispondenti (ma reazioni avverse si possono comunque manifestare per la presenza dell’antigene Mik, soprattutto nel gruppo A)
  • I gatti del gruppo AB, in caso di irreperibilità di sangue dello stesso gruppo, possono ricevere concentrati di globuli rossi di gruppo A o B, evitando di trasfondere la componente plasmatica che potrebbe contenere anticorpi nei confronti dell’antigene A o B presente sui globuli rossi del ricevente.
    Per quanto detto e non considerando l’antigene Mik, un
  • Gruppo B trasfuso in un A può dar vita a manifestazioni cliniche importanti di carattere agglutinante ed emolizzante in sede intravascolare che si realizza nel giro di poco tempo, per la presenza di anticorpi naturali.
  • Un gruppo A in un gruppo B in 1/3 dei casi darà origine a reazioni meno intense e a carattere emolizzante, con un’emivita delle emazie di 2 gg per rimozione extravascolare delle emazie con segni clinici poco evidenti.

Metodi per la caratterizzazione dei gruppi sanguigni

  • I kit rapidi a uso ambulatoriale per la determinazione del gruppo sanguigno mostrano buona sensibilità e specificità nella determinazione dei gruppi sanguigni, tuttavia il gruppo AB che può essere segnalato come B.
    Per questo motivo, idealmente, sarebbe consigliabile confermare la positività del gruppo B con metodiche dotate di maggiore specificità, come
  • l’agglutinazione in provetta, oppure eseguendo il test di back typing. In questi test il plasma dei gatti di gruppo sanguigno B o AB viene messo a contatto con eritrociti di gruppo A. Nel caso si tratti di plasma appartenente a un gatto di gruppo B si verifica una forte agglutinazione tra gli anticorpi plasmatici e gli antigeni eritrocitari, che è invece assente nel caso in cui il plasma appartenga a un gatto di gruppo AB.
    Questi test sono di difficile attuazione e andrebbero effettuati da laboratori qualificati.
  • Test genetici a partire da tamponi di mucosa buccale ma non sono in grado di determinare il gruppo AB.

Legislazione e caratteristiche per la donazione

Il ministero della salute ha stilato delle linee guida per la medicina trasfusionale in questa parte saranno brevemente riassunte, si rimanda al link per un approfondimento

I donatori devono essere testati per le infezioni trasmissibili per via ematica come quelle sostenute dai retrovirus FIV e FeLV e dai micoplasmi emotropi che sono in grado di sopravvivere fino a una settimana negli eritrociti delle unità ematiche conservate.


Caratteristiche di idoneità per la donazione di sangue nella specie felina

  • Peso corporeo 5-7 kg
  • Età 2-8 anni
  • Regolari vaccinazioni per calicivirosi, herpesvirosi, panleucopenia vaccinazioni infettiva, clamidiosi, leucemia virale (queste due per ultime vaccinazioni solo se il gatto è a rischio)
  • Carattere Docile
  • Quantità 1,5-2% del volume ematico corporeo da prelevare ogni 9 settimane non superando i 10 ml/kg
  • Identificazione Microchip registrato nella banca dati della struttura preposta al prelievo di sangue


Esami da eseguire prima di ogni donazione nei gatti donatori di sangue riportati nella linea guida ministeriale

  • Gruppo sanguigno A, B e AB
  • Esame emocromo citometrico RBC, Hgb, Hct, MCV, MCH, MCHC, emocromocitometrico RDW, WBC con formula leucocitaria, PLT, MPV con annessa valutazione microscopica di uno striscio di sangue per la ricerca di parassiti ematici. Esami biochimici, Proteine totali, albumina, urea, ALP, ALT
  • Profilo coagulativo PT, aPTT, fibrinogeno
  • Esami sierologici FIV, FeLV, FIP
  • In base alla zona geografica e all’epidemiologia anche Rickettsia spp, Anaplasma spp, Ehrlichia spp, Cytauxzoon felis e Leishmania spp.
  • Esame delle urine, esame chimico-fisico e del sedimento Esame delle
  • feci Esame parassitologico

puoi consultare anche; Linea guida per l’esercizio delle attività sanitarie riguardanti la medicina trasfusionale in campo veterinario

Materiali, metodi e procedure per la raccolta del sangue

La raccolta del sangue per il gatto può essere problematica per via delle quantità esigue di sangue rispetto all’anticoagulante presente nelle sacche concepite per l’umana che alla fine della trasfusione risulterebbero troppo diluite. In alternativa si può caricare dell’anticoagulante, raccolto da sacche in siringhe da 20 a 60 ml, o utilizzare appositi dispositivi chiusi per la raccolta del sangue. Un’altra problematica è legata all’indole del gatto, meno malleabile rispetto al cane che spesso può richiedere una contenzione farmacologica. Per questi ed altri aspetti di ordine pratico vi rimando a questa pubblicazione da cui ho tratto il materiale per la redazione di questo sunto. Veterinaria pg 43

EXTRA la prova di agglutinazione in provetta, è il gold standard per la determinazione dei gruppi sanguigni il test dotato della maggiore sensibilità e specificità. Utilizza come antisiero per l’identificazione degli eritrociti di gruppo A, il plasma di un gatto di gruppo B e come antisiero degli eritrociti di gruppo B, la lectina del Triticum vulgaris. Nonostante la maggiore sensibilità e specificità rispetto ad altri test disponibili, questa metodica ha alcuni svantaggi e limitazioni rappresentati dalla difficile reperibilità dei reagenti e dai lunghi tempi di esecuzione (circa 45 minuti). Per questi motivi è una tecnica il cui impiego è limitato ai laboratori di diagnostica specializzata o ai centri trasfusionali.