Concetto del test è quello di valutare in vitro (su vetrino o in provetta) eventuali reazioni provocate dal contatto tra il plasma del ricevente e i globuli rossi del donatore prova major, (emolisi e agglutinazione maggiore, ovvero la capacità del plasma del ricevente di emolizzare le emazie del ricevente e quindi la trasfusione) e il plasma del donatore con i globuli rossi del ricevente prova minor (emolisi e agglutinazione minore, ovvero la capacità del plasma del donatore di emolizzare le emazie del ricevente).
Prima di descrivere la procedura va fatto un cenno a riguardo di strumentazioni e prelievi necessari per eseguire la prova
- centrifuga
- incubatore a 37 gradi (può essere sufficiente qualsiasi apparecchiatura presente in struttura anche dedicata ad altri processi es. coagulazione)
- microscopio
- 1 prelivo in provetta EDTA per il soggetto richiedente e uno per il donatore
- 1 prelivo in provetta da siero di almeno 2ml, per il soggetto richiedente e uno per il donatore
- pipette dosatrici
Perchè effettuare questo test?
Nel gatto oltre i tradizionali antigeni A B e AB è stato identificato un nuovo antigene denominato Mik, la cui diffusione nella popolazione felina non può essere valutata per mancanza di test specifici. L’assenza di questo antigene eritrocitario nel gatto ricevente può essere associato alla presenza nel medesimo soggetto di anticorpi anti-Mik. Questo è vero sopratutto nei gatti gruppo A. Questi anticorpi sono responsabili di reazioni trasfusionali emolitiche acute anche in caso di trasfusioni compatibili del sistema di gruppo AB. Quindi anche in soggetti dello stesso gruppo, se vi è presenza di questi anticorpi si potranno manifestare reazioni di emolisi ed agglutinazione Major e minor.
E’ sempre raccomandato?
Effettivamente nelle trasfusioni effettuate tramite sacca, piuttosto che tramite donatore, può non essere necessaria, in quanto la sacca da trasfondere è priva di plasma, infatti le emazie sono sospese in una soluzione salina al mannitolo per il mantenimento della pressione osmotica e quindi viene a decadere il concetto di cross match.
Esecuzione del test; cross matching major e minor. Per il test di cross matching major: si preleveranno 1 provetta EDTA dal donatore e dal ricevente e una provetta da siero dal donatore e dal ricevente (2 ml) (può essere sufficiente anche solo l’EDTA
• centrifugare a 1000 rpm x 5-10 min. 2 ml di sangue intero (senza anticoagulante) del donatore e del ricevente (per ottenere siero), metterlo da parte previa identificazione. Centrifugare 2,5 ml di sangue intero (con EDTA) del donatore e ricevente (per ottenere eritrociti). NB se abbiamo deciso di operare con il solo prelievo di EDTA sarà il plasma surnatante ad essere conservato per la cross reazione, se invece abbiamo optato per la doppia provetta questo potrà essere gettato.
• Dal campione EDTA del donatore e del ricevente eliminare il plasma e il buffy coat. (come descritto sopra)
• Aggiungere soluzione salina (NaCl 0,9%) per risospendere gli eritrociti, fino al 4% (0,2 ml di eritrociti lavati in 4,8 ml di soluzione salina)
• Centrifugare, eliminare il surnatante e aggiungere nuovamente soluzione salina (4,8 ml). Ripetere il lavaggio per tre volte.
• sospensione per diminuire la formazione di rouleaux al termine dei lavaggi risospendere i globuli rossi lavati fino ad ottenere una sospensione di eritrociti al 4% (0,2 ml di eritrociti lavati in 4,8 ml di soluzione salina)
Compatibilità MAJOR, MINOR e controllo in provetta
- MAJOR: 2 gocce di siero/plasma del ricevente( 1 goccia 50 microlitri circa )+ 1 goccia di eritrociti del donatore.
- MINOR: 1 goccia di eritrociti ricevente + 2 gocce di siero/plasma del donatore
- Controllo ricevente: 1 goccia di eritrociti del ricevente + 2 gocce del siero del ricevente.
- Controllo donatore: 1 goccia di eritrociti del donatore + 2 gocce di siero del donatore.
- NB il controllo deve essere necessariamente negativo; una reazione tra emazie e siero/plasma dello stesso soggetto deve essere per forza considerato invalidante il test. Un autoagglutinazione nel ricevente potrebbe essere suggestiva di anemia emolitica immunomediata.
Incubazione il cross match major e minor può essere posto in una eppendorf o altra provetta ad incubare a 37° C per 15 min.
Centrifugazione per 15 sec.
Interpretazione dei risultati Osservare il colore del siero ad occhio per evidenziare la presenza di emolisi. Disporre una goccia da ogni eppendorf su vetrino portaoggetti per l’osservazione al microscopio e l’identificazione di agglutinazione.
Se compatibile: gli eritrociti sono separati.
Se incompatibile: emolisi o agglutinazione degli eritrociti (microagglutinazione).
Non confondere i rouleax con l’agglutinazione! nei primi le emazie sono impilate in colonna nelle seconde si trovano ammassate in formazioni globulari, tondeggianti. Gli animali con anemia emolitica immunomediata daranno un risultato positivo (incompatibile) alla prova MAJOR ed al controllo ricevente.
EXTRA nel gatto anche la prima trasfusione può portare reazioni emolitiche importanti e letali