Concetto del test è quello di valutare in vitro (su vetrino e in provetta) eventuali reazioni provocate dal contatto tra il plasma del ricevente e i globuli rossi del donatore “prova major” ovvero emolisi e agglutinazione maggiore. Questo si tradurrà in vivo nella capacità del plasma del ricevente di emolizzare le emazie del donatore e quindi la trasfusione. La prova minor (emolisi e agglutinazione minore), sarà caratterizzata dalla capacità del plasma del donatore di emolizzare le emazie del ricevente.
Prima di descrivere la procedura va fatto un cenno a riguardo di strumentazioni e prelievi necessari per eseguire la prova
- centrifuga
- incubatore a 37 gradi (può essere sufficiente qualsiasi apparecchiatura presente in struttura anche dedicata ad altri processi es. coagulazione)
- microscopio
- 1 prelivo in provetta EDTA per il soggetto richiedente e uno per il donatore
- 1 prelivo in provetta da siero di almeno 2ml, per il soggetto richiedente e uno per il donatore
- pipette dosatrici
Perchè effettuare questo test?
Nel gatto oltre i tradizionali antigeni A B e AB è stato identificato un nuovo antigene denominato Mik, la cui diffusione nella popolazione felina non può essere valutata per mancanza di test specifici. L’assenza di questo antigene eritrocitario nel gatto ricevente può essere associato alla presenza nel medesimo soggetto di anticorpi anti-Mik. Questo è vero sopratutto nei gatti gruppo A. Questi anticorpi sono responsabili di reazioni trasfusionali emolitiche acute anche in caso di trasfusioni compatibili del sistema di gruppo AB. Quindi anche in soggetti dello stesso gruppo, se vi è presenza di questi anticorpi si potranno manifestare reazioni di emolisi ed agglutinazione Major e minor.
E’ sempre raccomandato?
Effettivamente nelle trasfusioni effettuate tramite sacca, piuttosto che tramite donatore, se presenti emazie come concentrati privi di plasma, cioè sospese in una soluzione salina e al mannitolo utili al mantenimento della pressione osmotica, viene a decadere il concetto di cross match, sarà possibile effettuare la sola prova major, ovvero la capacità del ricevente di emolizzare la donazione.
Esecuzione del test; cross matching major e minor Si effettuerà un prelievo in provetta con anticoagulante Tris EDTA dal donatore e dal ricevente e un prelievo in una provetta da siero dal donatore e dal ricevente (min 2 ml per prelievo), può essere sufficiente anche il solo Tris EDTA.
• centrifugare a 1000 rpm x 5-10 min. 2 ml di sangue intero (senza anticoagulante) del donatore e del ricevente (per ottenere siero), metterlo da parte, in una provetta previa identificazione. Centrifugare, a 1000 rpm x 5-10 min. la provetta con EDTA del donatore e ricevente per ottenere un sedimento costituito da eritrociti.
NB se abbiamo deciso di operare con il solo prelievo di EDTA sarà il plasma surnatante della provetta EDTA ad essere conservato per la cross reazione e sarà consigliabile un prelievo da 2,5 ml, se invece abbiamo optato per la doppia provetta questo potrà essere gettato.
• Creare una sospensione al 4% di emazie con 4,8 ml di soluzione salina (NaCl 0,9%) e 0,2 ml di eritrociti precedentemente centrifugati.
• Centrifugare, eliminare il surnatante e aggiungere nuovamente soluzione salina (4,8 ml). Ripetere il lavaggio per tre volte.
• Per evitare la formazione di rouleaux al termine dei lavaggi risospendere i globuli rossi lavati fino ad ottenere una sospensione di eritrociti al 4%, come su.
Compatibilità MAJOR, MINOR e allestimento del controllo in provetta
- MAJOR: Miscelare 2 gocce di siero/plasma del ricevente ( 1 goccia corrisponde a circa 50 microlitri per chi possiede delle pipettatrici ) con 1 goccia di eritrociti del donatore in una provetta.
- MINOR: 1 goccia di eritrociti ricevente + 2 gocce di siero/plasma del donatore in provetta.
- Allestire contemporaneamente dei controlli
- Controllo ricevente: 1 goccia di eritrociti del ricevente + 2 gocce del siero del ricevente.
- Controllo donatore: 1 goccia di eritrociti del donatore + 2 gocce di siero del donatore.
- NB il controllo deve essere necessariamente negativo; una reazione tra emazie e siero/plasma dello stesso soggetto deve essere per forza considerato invalidante il test. Un autoagglutinazione nel ricevente potrebbe essere suggestiva di anemia emolitica immunomediata.
Incubazione il cross match major e minor può essere posto in una eppendorf o altra provetta ad incubare a 37° C per 10-15 min.
Interpretazione dei risultati Osservare il colore del siero ad occhio per evidenziare la presenza di emolisi. Disporre, su vetrino portaoggetti, una o due gocce di sospensione siero/plasma con eritrociti dalle provette precedentemente incubate. Se c’è agglutinazione già ad occhio nudo sarà possibile distinguere la formazione di flocculi di emazie, è consigliabile anche l’osservazione al microscopio per l’identificazione di un’eventuale agglutinazione. Per meglio interpretare e comprendere il risultato delle prove allego una pubblicazione dell’AIVPA dove troverete in fig. 5 due prove positive e due negative. Anche se la pubblicazione è dedicata alla medicina trasfusionale del cane non cambiano i criteri interpretativi, in quanto la prova è ripetibile anche per i cani e gli effetti di una eventuale incompatibilità sono del tutto sovrapponibili. Inoltre noterete che l’agglutinazione nel primo vetrino di sinistra è meno marcata e potrebbe essere confusa con dei semplici rouleax, per questo motivo torno a sottolineare l’opportunità di un’osservazione microscopica.
Se compatibile: gli eritrociti formano una sospensione omogenea del tutto simile al sangue normale.
Se incompatibile: Si evidenzierà emolisi o agglutinazione degli eritrociti.
NOTE CONCLUSIVE: La positività della prova major indicherà la capacità del plasma del ricevente di emolizzare le emazie del donatore, la positività della prova minor indicherà la capacità del plasma del donatore di emolizzare le emazie del ricevente. La positività della prova major non implica la contemporanea positività della prova minor e viceversa.
Non confondere i rouleax con l’agglutinazione! nei primi le emazie sono impilate in colonna nelle seconde si trovano ammassate in formazioni globulari, tondeggianti.
EXTRA nel gatto anche la prima trasfusione può portare reazioni emolitiche importanti e letali